Характеризующие клеток миграции в рамках трехмерной в Vitro рану среды
Summary
Цель настоящего Протокола заключается в оценке влияния про – и анти migratory факторов миграции клеток в матрицу трехмерного фибрина.
Abstract
В настоящее время большинство моделей в vitro ранозаживляющие, таких устоявшихся скретч анализов, включают изучение клеток миграции и раны закрытия на двумерной поверхности. Однако физиологической среды в которой в vivo заживления занимает место трехмерной вместо двухмерного. Она становится все более очевидным, что поведение клеток отличается значительно в двумерных и трехмерных средах; Таким образом существует потребность в более физиологически соответствующих в vitro моделей для изучения поведения миграции клеток в рану закрытие. Метод, описанный здесь позволяет для изучения миграции клеток в трехмерной модели, которая лучше отражает физиологических условиях чем ранее установленных двумерных скретч анализов. Цель этой модели является для оценки нарост клеток через изучение миграции клеток от тела сфероида, внедренные в матрицу фибрина в присутствии про – или анти migratory факторов. С помощью этого метода, нарост клеток от сфероида тела в матрицу трехмерного можно наблюдать и легко поддающихся количественной оценке с течением времени через brightfield микроскопии и анализа сфероида площади тела. Влияние pro перелетных и/или ингибирующих факторов на ячейку миграции также может быть оценен в этой системе. Этот метод обеспечивает исследователей с простой метод анализа миграции клеток в трехмерной рану связанных матрицы в пробирке, увеличивая таким образом актуальность в пробирке клеток исследования предварительного использования животных в естественных условиях модели.
Introduction
Заживление ран — сложный процесс, который приводит к восстановлению целостности тканей, после травмы. Этот процесс разбит на четыре перекрывающихся стадии, охватываемых гемостаз, воспаление, распространением и реконструкции, которые каждый регулируются сложной сочетание растворимых подсказки, ячейки матрицы взаимодействия и коммуникаций ячеек. 1 , 2 согласование этих подсказок управляет множество клеточных реакций в заживлении ран, главное, включая миграции клеток. 3 , 4 ячейки миграция представляет собой весьма динамичный процесс зависит от сотовой фенотипы и биохимические и биофизические свойства окружения внеклеточного матрикса. 5 клеток непрерывно зондировать их внеклеточного матрикса среды при посредничестве Интегрин путями; Этот процесс позволяет клетки смысле широкий спектр свойства матрицы, включая топографию, жесткость и родов. Двухмерный (2D) анализ миграции клеток показывает, что миграция обусловлена формирования lamellipodia на переднем крае через поколение актина накаливания связки. Последующее формирование фокуса спаек на переднем крае, в сочетании с actomyosin driven сужением и втягивание в задней кромки, диски клетки вперед. 6 клеточной миграции трехмерные (3D) в настоящее время не вполне понятно, однако, последние исследования показывают, что 3D миграции заметно отличается от выше описанный механизм в 2D и скорее всего обусловлен укрепляющий механизмов. Например недавние исследования, проведенные Петри и др. продемонстрировал, что, в зависимости от свойства ECM, клетки в 3D матрицы можно переключаться между lamellipodium и lobopodium приводом механизмов миграции. 7 потому что клетки миграция является критически важным компонентом ранозаживляющее ответ, 3D модели миграции клеток имеют решающее значение для понимания физиологической реакции на различные раздражители во время заживления ран. Хотя было показано, что миграционные поведение клеток на 2D поверхности значительно варьируются от миграции в 3D матрицы, самые последние в vitro модели миграции клеток во время заживления процесса, в том числе устоявшихся скретч assay, используют 2D однослойная культур. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 более недавно разработали анализов использовали 3D матрицы, но по-прежнему культуры клеток в монослое поверх матрицы, ограничивая тем самым возможность действительно резюмировать трехмерность клетки окружающей среды в vivo. 15
Метод, описанный здесь предназначен для изучения миграции клеток в физиологически соответствующих 3D-модели, а не на 2D поверхности, чтобы получить более надежные понимание ответов миграции, связанные с прикладной раздражителей. Этот метод позволяет для оценки миграции клеток внутри 3D фибринового сгустка матрицы при наличии факторов, которые тормозят пути, связанные с миграцией ячейки или активировать. Матрица фибрина был выбран для этого метода за счет фибрина играет важнейшую роль на ранних этапах заживления ран; следующие травмы, сгусток фибрина образуется в рану среды остановить потери крови и служит леску для первоначальная клеточная инфильтрация ткани ремонт и реконструкцию. 2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 Кроме того, клинически, как хирургические герметик используется фибрина и состав герметики был привязан к миграции клеток и ultimate исцеление результатов. Предыдущие исследования, Кокс и др. расследование миграции фибробластов с сгустков фибрина, состоит из различной фибрина и концентрации тромбина для целей оптимизации фибринового герметика. В этих исследованиях была количественно миграции клеток из сгустков фибрина на пластмассовые блюда. 20 здесь мы представляем метод, который позволяет для количественной оценки миграции клеток в среде 3D фибрина. В то время как метод, описанный в настоящем Протоколе конкретно использует фибрина, эта модель действия можно легко изменить для использования альтернативных матрица материалы по желанию, например коллаген или других 3D матрицы. Кроме того мы представляем использование сфероидов фибробластов в этот assay, потому что миграции фибробластов в рану кровать имеет первостепенное значение для синтеза внеклеточного матрикса и ткани ремонта/реконструкции. Однако во время ремонта процесс нейтрофилы являются первый тип ячейки для переноса в рану кровать, следуют макрофагов. Фибробласты начинают затем проникнуть примерно через 48 часов после первоначальной травмы, в начале пролиферативной стадии процесс заживления раны окружающей среды. 19 этот assay может быть легко изменен для включения нейтрофилов, макрофагов или другие типы клеток, чтобы оценить влияние изменений в структуре сгусток фибрина миграции этих типов клеток. 21
Для реализации этот assay, во-первых, сфероиде фибробластов формируется с помощью изменения методов, описанных ранее для стволовых клеток культуры. 22 фибробластов сфероида впоследствии передается в матрицу 3D фибрина, и следствием затем можно легко контролировать и количественно в течение нескольких дней. Этот протокол учитывает 3D физиологических систем, внедрив сфероидов 3D ячейку в матрице фибрина, таким образом избегая ограничений в релевантности, вызвали рост 2D поверхности с помощью монослоя клеток для мигрирующих поведение модели, в то время как все еще позволяющ для оценки поведения клеток в среде высоко контролируемых в пробирке .
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол позволяет для изучения миграции клеток в заживлении ран связанные ECMs через 3D модель в пробирке . Решающим шагом в правильное выполнение процедуры является надлежащее развитие фибробластов сфероидов; концентрация клеток во время подготовки был оптимизирован дать на…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование для проведения этой работы была предоставлена через американской ассоциации сердца (16SDG29870005) и Северная Каролина государственный университет научно-исследовательский и инновационный семян финансирования.
Materials
| Materials | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine | VWR | VWRL0148-0500 | DMEM already containing L-glutamine can also be used |
| 100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic | VWR | 10861-594 | Dishes of any size can be used for hanging drop culture |
| Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested | Sigma-Aldrich | 12306C-500ML | |
| L-glutamine | Fisher Scientific | ICN1680149 | Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Human Dermal Fibroblasts, neonatal | Thermo Fisher | C0045C | Can be replaced with other cell type of interest |
| 21 G x 1 1/2' needle | BD | 305167 | 22 G x 1 1/2 needles will also work |
| 1 mL syringe | VWR | 89174-491 | Syringes of any volume can be used |
| Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells) | VWR | 82051-004 | |
| Human Fibrinogen – Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted | Enzyme Research Laboratories | FIB 3 | Can be replaced with matrix protein of interest |
| Human Alpha Thrombin | Enzyme Research Laboratories | HT 1002a | May not be necessary depending on matrix protein of interest |
| Equipment | |||
| BSL2 cell culture hood | |||
| Cell culture incubator | |||
| Inverted microscope with 10X objective | |||
| Centrifuge compatibile with 15 mL tubes |
Referências
- Chester, D., Brown, A. C. The role of biophysical properties of provisional matrix proteins in wound repair. Matrix Biol. , (2016).
- Martin, P., Leibovich, S. J. Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly. Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).
- Lin, B., Yin, T., Wu, Y. I., Inoue, T., Levchenko, A. Interplay between chemotaxis and contact inhibition of locomotion determines exploratory cell migration. Nat Commun. 6, 6619 (2015).
- Ngalim, S. H., et al. Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy. J Vis Exp. (74), (2013).
- Charras, G., Sahai, E. Physical influences of the extracellular environment on cell migration. Nat Rev. Mol Cell Biol. 15 (12), 813-824 (2014).
- Petrie, R. J., Yamada, K. M. Fibroblasts Lead the Way: A Unified View of 3D Cell Motility. Trends Cell Biol. 25 (11), 666-674 (2015).
- Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).
- Carlson, M. W., Dong, S., Garlick, J. A., Egles, C. Tissue-Engineered Models for the Study of Cutaneous Wound-Healing. Bioengineering Research of Chronic Wounds. , 263-280 (2009).
- Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. J Cell Bio. 184 (4), 481-490 (2009).
- Fraley, S. I., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat Rev. Mol Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).
- Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zänker, K. S., Dittmar, T. Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix. J Vis Exp. (92), (2014).
- Jonkman, J. E. N., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).
- Lämmermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Chen, Z., Yang, J., Wu, B., Tawil, B. A Novel Three-Dimensional Wound Healing Model. J Dev Biol. 2 (4), 198-209 (2014).
- Ross, R., Benditt, E. P. Wound healing and collagen formation. The J Cell Biol. 12 (3), 533-551 (1962).
- Sproul, E. P., Argraves, W. S. A cytokine axis regulates elastin formation and degradation. Matrix Biol. 32 (2), 86-94 (2013).
- Almine, J. F., Wise, S. G., Weiss, A. S. Elastin signaling in wound repair. Birth Defects REs C Embryo Today. 96 (3), 248-257 (2012).
- Tracy, L. E., Minasian, R. A., Caterson, E. J. Extracellular Matrix and Dermal Fibroblast Function in the Healing Wound. Adv Wound Care. 5 (3), 119-136 (2016).
- Cox, S., Cole, M., Tawil, B. Behavior of Human Dermal Fibroblasts in Three-Dimensional Fibrin Clots: Dependence on Fibrinogen and Thrombin Concentration. Tissue Eng. 10 (5-6), 942-954 (2004).
- Brown, A. C., Barker, T. H. Fibrin-based biomaterials: Modulation of macroscopic properties through rational design at the molecular level. Acta Biomaterialia. 10 (4), 1502-1514 (2014).
- Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H. Preparation of anti-inflammatory mesenchymal stem/precursor cells (MSCs) through sphere formation using hanging drop culture technique. Curr Protoc Stem Cell Biol. 28, (2014).
- Bainbridge, P. Wound healing and the role of fibroblasts. J Wound Care. 22 (8), 410-412 (2013).
