Karaktärisera cellmigration inom tredimensionell In Vitro sår miljöer

Summary

Målet med detta protokoll är att utvärdera effekten av pro – och anti – migratory faktorer på cellmigration inom en tredimensionell fibrin matris.

Abstract

För närvarande, de flesta i vitro modeller av sårläkning, såsom väletablerade scratch analyser, inbegriper studera cell migration och såret stängning på tvådimensionella ytor. Fysiologiska miljön i vilken in-vivo sårläkning sker är dock tredimensionella i stället för tvådimensionella. Det blir allt tydligare att cellen skiljer sig kraftigt i tvådimensionella vs. tredimensionella miljöer; Därför finns det ett behov för mer fysiologiskt relevanta in vitro- modeller för att studera cell migration beteenden i sårslutning. Den metod som beskrivs häri möjliggör studiet av cellmigration i en tredimensionell modell som bättre speglar fysiologiska förhållanden än tidigare etablerade tvådimensionell scratch analyser. Syftet med denna modell är att utvärdera cell utväxt via undersökning av cellmigration från en sfäroid kroppen inbäddad i en fibrin matris i närvaro av pro – eller anti – migratory faktorer. Med den här metoden cell utväxt från sfäroid kroppen i en tredimensionell matris kan observeras och är lätt kvantifierbara över tid via brightfield mikroskopi och analys av sfäroid organ område. Effekten av pro-flyttande eller hämmande faktorer på cellmigration kan också utvärderas i detta system. Denna metod ger forskare en enkel metod att analysera cellmigration i tredimensionella såret associerade matriser i vitro, cellen vilket ökar relevansen av in vitro -studier före användning av in-vivo djur modeller.

Introduction

Sårläkning är en komplicerad process som resulterar i återställandet av vävnad integritet efter skada. Denna process är uppdelat i fyra överlappande steg omfattas av hemostas, inflammation, spridning och remodeling, som var reglerade genom en komplex kombination av lösliga ledtrådar, cell-matrix interaktioner och cell-cell kommunikation. ^{1 , 2} orchestrationen av dessa signaler styr en mängd cellulära svar i sårläkning inklusive, ännu viktigare, cellmigration. ^{3 , 4} cellmigration är en mycket dynamisk process som är beroende av både cellulära fenotyper och biokemiska och biofysiska egenskaper av den extracellulära matrix-miljön. ⁵ celler kontinuerligt sond deras extracellular matris miljö genom integrin-medierade vägar; denna process låter celler att känna ett brett utbud av matrix egenskaper inklusive topografi, styvhet och instängdhet. Tvådimensionell (2D) analys av cellmigration visar att migration drivs av lamellipodia bildning i framkant genom generering av aktin filament buntar. Efterföljande bildandet av fokal sammanväxningar i framkant, i kombination med actomyosin driven kontraktion och upprullning på biskäret, driver cellen framåt. ⁶ three-dimensional (3D) cellulär migration är för närvarande inte förstått, färska studier visar dock att 3D migration är markant annorlunda än den ovan beskrivna mekanism i 2D och drivs sannolikt alterative mekanismer. Till exempel nyligen genomförda studier av Petrie et al. visat att, beroende på egenskaperna för ECM, celler i 3D matriser kan växla mellan lamellipodium och lobopodium drivande mekanismer av migration. ⁷ eftersom cellmigration är en kritisk komponent i såret helande svar, 3D-modeller av cellmigration är avgörande för att förstå fysiologiska reaktioner på olika stimuli under sårläkning. Även om cellen flyttande beteende på 2D ytor har visat sig variera kraftigt från migration i 3D matriser, utnyttja mest aktuella in vitro- modeller av cellmigration under sårläkningsprocessen, inklusive den väletablerade scratch test, 2D enskiktslager kulturer. ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14} mer nyligen utvecklade testmetoder har utnyttjat en 3D matrix, men fortfarande kultur celler i en enskiktslager ovanpå matrisen, vilket begränsar möjligheten att verkligen sammanfatta de tre dimensionerna av cell miljön invivo. ¹⁵

Syftet med den metod som beskrivs häri är att studera cellmigration i ett fysiologiskt relevanta 3D-modellen, snarare än på en 2D-yta, för att få en mer robust förståelse av migration svaren är associerad med de tillämpa stimuli. Denna metod möjliggör utvärdering av cellmigration inom en 3D fibrin clot matris i närvaro av faktorer som kan aktivera eller hämma vägar som är associerad med cellmigration. En fibrin matris valdes för denna metod på grund av den kritiska roll fibrin spelar i de tidiga stadierna av sårläkning; följande skada, en fibrin propp bildas inom såret miljöer att hejda blodförlust och fungerar som en klätterställning för inledande cell infiltration under vävnad reparation och ombyggnad. ^{2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} dessutom fibrin används kliniskt som en kirurgisk tätningsmedel och sammansättningen av tätningsmedel har varit knuten till cellmigration och ultimate healing utfall. En tidigare studie av Cox et al. undersökt fibroblast migration med fibrin blodproppar består av varierande fibrin och trombin koncentrationer i syfte att optimera ett fibrinlim. I dessa studier kvantifierades migration av celler av fibrin blodproppar på plast rätter. ²⁰ här presenterar vi en metod som möjliggör för kvantifiering av migration av celler inom 3D fibrin miljön. Medan den metod som beskrivs i detta protokoll specifikt använder fibrin, kan denna modell lätt ändras för att använda alternativa matris material som önskas, till exempel kollagen eller andra 3D matriser. Dessutom presenterar vi användningen av fibroblast spheroids i denna analys eftersom fibroblast migration in i såret sängen är av största vikt för extracellulärmatrix syntes och vävnad reparation/ombyggnad. Men under reparation är processen neutrofiler den första celltypen att migrera in i såret sängen, följt av makrofager. Fibroblaster börjar sedan att infiltrera såret miljön cirka 48 timmar efter inledande skada, i början av den proliferativa fasen av sårläkningsprocessen. ¹⁹ denna analys kan enkelt modifieras för att inkludera neutrofiler, makrofager eller andra celltyper att bedöma hur förändringar i fibrin clot struktur påverkar migration av dessa celltyper. ²¹

För att genomföra denna analys, först bildas en fibroblast sfäroid med hjälp av en ändring av tekniker som tidigare beskrivits för stamceller kultur. ²² den fibroblast sfäroid överförs därefter till en 3D fibrin matris och utväxt sedan enkelt kan övervakas och kvantifieras under flera dagar. Detta protokoll tar hänsyn till 3D av fysiologiska system genom att bädda in 3D cell spheroids inom en fibrin matris, därmed undvika begränsningarna i betydelse genom en använda en 2D tillväxt yta med en cell enskiktslager modell flyttande beteende, medan medger utvärdering av cell beteende i en starkt kontrollerad in vitro- miljö.

Protocol

1. dag 1: Cell- och REAGENSBEREDNING Obs: preparering av cellen och reagens bör utföras i biologiska säkerhetsdragskåp att förhindra kontaminering av proverna. Varma filtreras Dulbecco ' s ändrad Eagle ' s Medium (DMEM), fetalt bovint serum (FBS), L-glutamin och penicillin/streptomycin i 37 ° C vattenbad. Förbered neonatal mänskliga dermal fibroblast (HDFn) media genom att komplettera värmde DMEM med 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin och 1% L-glutamin….

Representative Results

Sfäroid kultur kan utnyttjas för att kunna utvärdera effekten av pro- och anti flyttande agenter på fibroblast migration in vitro-3D fibroblast spheroids kan bildas via hängande droppe kultur under 72 h (figur 1). Efter perioden kultur, spheroids är inbäddade i matrisen clot och avbildas med hjälp av brightfield mikroskopi (figur 2). De första områdena i de spheroids (avbildad i figuren som de områ…

Discussion

Detta protokoll kan prövningen av cellmigration i sårläkning associerade ECMs genom en in vitro- 3D-modellen. Ett avgörande steg för korrekt genomförande av förfarandet är en sund utveckling av fibroblast spheroids; cellkoncentrationen under beredning var optimerad för att ge en initial koncentration av 2.500 celler/drop, att spheroids att bilda tillförlitligt över en inkubationstid på 72 h. Om ett otillräckligt antal celler används, spheroids kan inte samlade effektivt och kan bryta isär på vill…

Materials

Materials
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine	VWR	VWRL0148-0500	DMEM already containing L-glutamine can also be used
100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic	VWR	10861-594	Dishes of any size can be used for hanging drop culture
Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested	Sigma-Aldrich	12306C-500ML
L-glutamine	Fisher Scientific	ICN1680149	Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine
Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
Human Dermal Fibroblasts, neonatal	Thermo Fisher	C0045C	Can be replaced with other cell type of interest
21 G x 1 1/2' needle	BD	305167	22 G x 1 1/2 needles will also work
1 mL syringe	VWR	89174-491	Syringes of any volume can be used
Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells)	VWR	82051-004
Human Fibrinogen – Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted	Enzyme Research Laboratories	FIB 3	Can be replaced with matrix protein of interest
Human Alpha Thrombin	Enzyme Research Laboratories	HT 1002a	May not be necessary depending on matrix protein of interest
Equipment
BSL2 cell culture hood
Cell culture incubator
Inverted microscope with 10X objective
Centrifuge compatibile with 15 mL tubes