İçinde üç boyutlu Vitro hücre göç karakterize ortamlar yara
Summary
Bu iletişim kuralı yanlısı ve anti migratory faktörlerin etkisi hücre geçiş bir üç boyutlu fibrin matris içinde değerlendirmek için hedeftir.
Abstract
Şu anda, en vitro model, iyileşmesi gibi köklü sıfırdan deneyleri, hücre göç ve yara kapatma iki boyutlu yüzeyler eğitim içerir. Ancak, yer alır şifa hangi vivo içinde yara fizyolojik ortamında üç boyutlu tercihan–dan iki boyutlu. Hücre davranışı büyük ölçüde olarak farklı olduğunu giderek daha açık hale geliyor iki boyutlu ve üç boyutlu ortamlarda; Bu nedenle, yara kapatma hücre geçiş davranışları eğitim için daha fizyolojik ilgili vitro modelleri için bir ihtiyaç vardır. Burada açıklanan yöntemi daha iyi daha önce kurulan iki boyutlu sıfırdan deneyleri fizyolojik şartlarda yansıtan bir üç boyutlu model hücre göç çalışmanın olanak sağlar. Hücre akıbet hücre göç pro veya anti migratory faktörlerin varlığında fibrin matris içinde gömülü bir küresel gövdesinden çekin incelenmesi yoluyla değerlendirmek için bu model amacı budur. Bu yöntemi kullanarak, hücre yapılan üç boyutlu bir matris küresel vücuttan gözlenen ve aydınlık alan mikroskobu ve küresel gövde alanı analizi ile zaman içinde kolayca ölçülebilir. Pro-göçmen ve/veya inhibitör faktörleri etkisi hücre göç de bu sistem içinde değerlendirilebilir. Bu yöntem araştırmacılar hücre göç ilişkili üç boyutlu yara matrisler vitroanaliz basit bir yöntem sağlar, böylece artan alaka içinde in vitro hücre önceden in vivo hayvan kullanımı için çalışmalar modelleri.
Introduction
Yara iyileşmesi yaralanma takip doku bütünlüğü restorasyon sonuçları karmaşık bir süreçtir. Bu işlem içine hemostazın, inflamasyon, yayılması ve remodeling, tarafından çevrelenmiş dört örtüşen aşamaları olan her düzenlenmektedir çözünür cues, hücre-matris etkileşimleri ve hücre-hücre iletişim karmaşık bir kombinasyonu tarafından bozuldu. 1 , 2 bu cues orkestrasyon hücresel yanıt-e doğru dahil, önemlisi, hücre göç yara iyileşmesinde çok sayıda kontrol eder. 3 , 4 hücre geçiş bağımlı hücresel fenotipleri ve hücre dışı matriks ortamın Biyokimya ve biyofizik özelliklerini üzerinde son derece dinamik bir süreç değil. 5 hücreler sürekli hücre dışı matriks çevreleri integrin aracılı yollar aracılığıyla araştırma; Bu süreci hücreleri matris özellikleri topografya, sertlik ve hapsi de dahil olmak üzere geniş bir anlamda verir. İki boyutlu (2D) analizi hücre göç göç öncü aktin filaman demetleri nesil aracılığıyla, lamellipodia formasyonu tarafından tahrik edilmektedir gösterir. Öncü kasılma ve retraksiyon firar kenarında tahrik actomyosin ile birlikte, odak yapışıklıklar sonraki oluşumunu hücrenin ileri sürüyor. 6 boyutlu üç (3D) hücresel geçiş şu anda iyi anlaşılamamıştır, ancak, son yıllarda yapılan çalışmalarda 3D geçiş daha belirgin farklı olduğunu ispat yukarıda adı geçen mekanizması 2D açıklanan ve büyük olasılıkla değiştirici mekanizma ile tahrik edilmektedir. Örneğin, son yıllarda yapılan çalışmalarda Petrie ve arktarafından. ECM özelliklerine bağlı olarak, 3D Matris hücrelerinde lamellipodium geçiş mekanizmalarının tahrik lobopodium arasında geçiş yapabilirsiniz, gösterdi. 7 hücre geçiş yanıt şifa yara, kritik bir bileşeni olduğundan hücre göç 3D modelleri yara iyileşmesi sırasında çeşitli uyaranlara fizyolojik yanıtlarını anlamak için kritik önem taşımaktadır. 2D yüzeylerde hücre göç davranışı büyük ölçüde göç 3D matrisler farklı olduğu gösterilmiştir, ancak en güncel vitro modelleri hücre göç sırasında köklü sıfırdan tahlil dahil olmak üzere işlem, şifa yara 2D kullanmak monolayer kültürler. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 deneyleri daha son zamanlarda geliştirilen 3D matris kullanılan, ama hala böylece yeteneği gerçekten hücre çevre three-dimensionality özetlemek için sınırlama monolayer matrix, üstüne hücrelerde kültür içinde vivo. 15
Burada açıklanan yöntemin amacı ile uygulanan uyaranlara ilişkili geçiş yanıt daha sağlam bir anlayış kazanmak için hücre göç fizyolojik ilgili bir 3D modeli yerine bir 2D yüzey incelemektir. Bu yöntem, hücre geçiş etkinleştirmek veya hücre geçiş ile ilişkili yollar engelleyen faktörleri varlığında bir 3D fibrin pıhtısı matris içinde değerlendirilmesi için sağlar. Fibrin matris nedeniyle kritik rol fibrin yara iyileşmesi erken aşamalarında, bu yöntem için seçildi; Aşağıdaki yaralanma, fibrin pıhtısı yara ortamlar içinde kan kaybı kök oluşturduğu ve ilk hücre infiltrasyonu sırasında doku onarım ve tadilat için bir iskele olarak hizmet vermektedir. 2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 Ayrıca, fibrin cerrahi bir mastik olarak klinik olarak kullanılır ve Mastikler bileşimi hücre göç ve nihai sonuçları şifa için bağlı olmuştur. Cox ve arktarafından önceki bir çalışma. fibroblast geçiş değişen fibrin ve fibrin dolgu macunu en iyi duruma getirme amacıyla Trombin konsantrasyonları oluşan fibrin pıhtısı ile araştırıldı. Bu çalışmalarda, plastik yemekleri üzerine fibrin pıhtısı hücreleri geçirilmesi sayısal. 20 burada miktar göç 3D fibrin ortamı içindeki hücreleri için izin veren bir yöntem mevcut. Bu protokol için özel olarak açıklanan yöntemi fibrin kullanırken, bu model alternatif matris malzeme kullanmak istediğiniz gibi kollajen veya diğer 3B matrisleri gibi için kolayca değiştirilebilir. Ayrıca, biz fibroblast geçiş yara yatağına büyük önem hücre dışı matriks sentezi ve doku onarım/tadilat olduğundan bu tahlil fibroblast pulcuklarının kullanımı mevcut. Ancak, onarım sırasında süreç nötrofiller makrofajlar tarafından takip yara yatağa geçirmek için ilk hücre tipi vardır. Fibroblastlar sonra yaklaşık 48 saat sonra ilk yaralanma, yara iyileşme süreci proliferatif faz başında yara ortamı sızmaya başlar. 19 bu tahlil kolayca nötrofil, makrofajlar veya fibrin pıhtısı yapısındaki değişiklikler geçiş bu hücre tiplerinin nasıl etkiler değerlendirmek için diğer hücre tipleri eklemek için değiştirilmiş olabilir. 21
Bu tahlil uygulamak için ilk olarak, fibroblast küresel bir değişiklik kök hücre kültürü için daha önce açıklanan teknikleri kullanarak oluşturulur. 22 fibroblast küresel daha sonra 3D fibrin matris aktarılır ve sonucu sonra kolayca izlenebilir ve birkaç gün içinde sayılabilir. Bu iletişim kuralı dikkate fizyolojik sistemleri 3D 3D cep pulcuklarının fibrin matris içinde katıştırma tarafından alır böylece sınırlamaları hakkında getirdiği bir 2D büyüme yüzeyi ile bir hücre monolayer model göç davranışı için kullanarak alaka içinde kaçınarak, süre hala hücre davranışı son derece kontrollü vitro ortamda değerlendirilmesi için izin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yara iyileşmesinde hücre göç incelenmesi ECMs bir vitro 3D modeli ile ilişkili bu iletişim kuralı sağlar. Çok önemli bir adım olarak uygun yordam yürütülmesini fibroblast pulcuklarının uygun gelişmedir; hücre toplama hazırlık sırasında 2.500 hücreler/damla, ilk bir konsantrasyon vermek için optimize edilmiş pulcuklarının formu için güvenilir bir 72 h kuluçka döneminde izin. Hücreleri yetersiz sayıda kullandıysanız, pulcuklarının etkili toplamak değil ve transfer ve fibrin ka…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu iş için finansman Amerikan Kalp Derneği (16SDG29870005) ve North Carolina Devlet Üniversitesi Araştırma ve yenilik tohum finansman ile sağlandı.
Materials
| Materials | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine | VWR | VWRL0148-0500 | DMEM already containing L-glutamine can also be used |
| 100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic | VWR | 10861-594 | Dishes of any size can be used for hanging drop culture |
| Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested | Sigma-Aldrich | 12306C-500ML | |
| L-glutamine | Fisher Scientific | ICN1680149 | Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Human Dermal Fibroblasts, neonatal | Thermo Fisher | C0045C | Can be replaced with other cell type of interest |
| 21 G x 1 1/2' needle | BD | 305167 | 22 G x 1 1/2 needles will also work |
| 1 mL syringe | VWR | 89174-491 | Syringes of any volume can be used |
| Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells) | VWR | 82051-004 | |
| Human Fibrinogen – Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted | Enzyme Research Laboratories | FIB 3 | Can be replaced with matrix protein of interest |
| Human Alpha Thrombin | Enzyme Research Laboratories | HT 1002a | May not be necessary depending on matrix protein of interest |
| Equipment | |||
| BSL2 cell culture hood | |||
| Cell culture incubator | |||
| Inverted microscope with 10X objective | |||
| Centrifuge compatibile with 15 mL tubes |
Referências
- Chester, D., Brown, A. C. The role of biophysical properties of provisional matrix proteins in wound repair. Matrix Biol. , (2016).
- Martin, P., Leibovich, S. J. Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly. Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).
- Lin, B., Yin, T., Wu, Y. I., Inoue, T., Levchenko, A. Interplay between chemotaxis and contact inhibition of locomotion determines exploratory cell migration. Nat Commun. 6, 6619 (2015).
- Ngalim, S. H., et al. Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy. J Vis Exp. (74), (2013).
- Charras, G., Sahai, E. Physical influences of the extracellular environment on cell migration. Nat Rev. Mol Cell Biol. 15 (12), 813-824 (2014).
- Petrie, R. J., Yamada, K. M. Fibroblasts Lead the Way: A Unified View of 3D Cell Motility. Trends Cell Biol. 25 (11), 666-674 (2015).
- Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).
- Carlson, M. W., Dong, S., Garlick, J. A., Egles, C. Tissue-Engineered Models for the Study of Cutaneous Wound-Healing. Bioengineering Research of Chronic Wounds. , 263-280 (2009).
- Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. J Cell Bio. 184 (4), 481-490 (2009).
- Fraley, S. I., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat Rev. Mol Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).
- Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zänker, K. S., Dittmar, T. Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix. J Vis Exp. (92), (2014).
- Jonkman, J. E. N., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).
- Lämmermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Chen, Z., Yang, J., Wu, B., Tawil, B. A Novel Three-Dimensional Wound Healing Model. J Dev Biol. 2 (4), 198-209 (2014).
- Ross, R., Benditt, E. P. Wound healing and collagen formation. The J Cell Biol. 12 (3), 533-551 (1962).
- Sproul, E. P., Argraves, W. S. A cytokine axis regulates elastin formation and degradation. Matrix Biol. 32 (2), 86-94 (2013).
- Almine, J. F., Wise, S. G., Weiss, A. S. Elastin signaling in wound repair. Birth Defects REs C Embryo Today. 96 (3), 248-257 (2012).
- Tracy, L. E., Minasian, R. A., Caterson, E. J. Extracellular Matrix and Dermal Fibroblast Function in the Healing Wound. Adv Wound Care. 5 (3), 119-136 (2016).
- Cox, S., Cole, M., Tawil, B. Behavior of Human Dermal Fibroblasts in Three-Dimensional Fibrin Clots: Dependence on Fibrinogen and Thrombin Concentration. Tissue Eng. 10 (5-6), 942-954 (2004).
- Brown, A. C., Barker, T. H. Fibrin-based biomaterials: Modulation of macroscopic properties through rational design at the molecular level. Acta Biomaterialia. 10 (4), 1502-1514 (2014).
- Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H. Preparation of anti-inflammatory mesenchymal stem/precursor cells (MSCs) through sphere formation using hanging drop culture technique. Curr Protoc Stem Cell Biol. 28, (2014).
- Bainbridge, P. Wound healing and the role of fibroblasts. J Wound Care. 22 (8), 410-412 (2013).
