O c. elegans intestino como um modelo para intercelular Lumen morfogênese e In Vivo biogênese de membrana polarizada no nível de célula única: rotulagem por anticorpos, RNAi perda--função de análise e de imagem

Nan Zhang; Liakot A Khan; Edward Membreno; Gholamali Jafari; Siyang Yan; Hongjie Zhang; Verena Gobel

doi:10.3791/56100

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Artigo de método

O c. elegans intestino como um modelo para intercelular Lumen morfogênese e In Vivo biogênese de membrana polarizada no nível de célula única: rotulagem por anticorpos, RNAi perda--função de análise e de imagem

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DOI:

10.3791/56100

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3 de outubro de 2017

Nan Zhang¹^,² , Liakot A Khan¹ , Edward Membreno¹ , Gholamali Jafari¹ , Siyang Yan¹ , Hongjie Zhang¹^,³ , Verena Gobel¹

¹Mucosal Immunology and Biology Research Center, Developmental Biology and Genetics Core, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, ²College of Life Sciences, Jilin University, ³Faculty of Health Sciences, University of Macau

Neste artigo

Resumo

O transparente c. elegans intestino pode servir como uma"em vivo câmara de tecido" para estudar a biogênese de membrana e lúmen apicobasal nível unicelular e subcellular durante tubulogenesis multicelulares. Este protocolo descreve como combinar padrão de rotulagem, genética/perda--função de RNAi e abordagens microscópicas para dissecar esses processos em um nível molecular.

Resumo

Tubos multicelulares, unidades fundamentais de todos os órgãos, são compostos de células endoteliais ou epiteliais polarizadas, com membranas apicais forro as membranas lúmen e basolateral, entrar em contato com os outros e/ou a matriz extracelular. Como esta assimetria da membrana distinta é estabelecida e mantida durante a morfogênese do órgão é ainda uma questão não resolvida de biologia celular. Este protocolo descreve o intestino c. elegans como modelo de análise de biogênese de membrana polarizada durante a morfogênese de tubo, com ênfase na biogênese apical da membrana e lúmen. Epitélio intestinal de camada única de células vinte e o c. elegans é organizado em um simples tubo bilateralmente simétrico, permitindo a análise em um nível de célula única. Polarização de membrana ocorre concomitantemente com polarizada divisão celular e migração durante a embriogênese precoce, mas de novo polarizada biogênese de membrana continua durante todo o crescimento larval, quando as células já não se proliferam e se mover. A última configuração permite separar alterações subcelulares que medeiam simultaneamente estes processos de polarização diferentes, difícil distinguir na maioria dos modelos de polaridade. Apical-, basolateral da membrana-, juncional-, do citoesqueleto- e endomembranoso componentes podem ser rotulados e rastreadas durante todo o desenvolvimento por proteínas da fusão de GFP ou avaliadas por em situ mancha do anticorpo. Juntamente com versatilidade genética do organismo, o intestino de c. elegans , portanto, fornece um modelo exclusivo na vivo para o visual, no desenvolvimento e a análise genética molecular da membrana polarizada e biogênese de tubo. Incluem os métodos específicos (padrão) descritos aqui como: rotular componentes subcelulares intestinais pela mancha do anticorpo; analisar genes envolvidos na biogênese de membrana polarizada por estudos de perda-de-função adaptados para os genes tubulogenesis normalmente essencial; avaliar a polaridade defeitos durante diferentes estágios do desenvolvimento; interpretar os fenótipos de epifluorescência, contraste de interferência diferencial (DIC) e microscopia confocal; quantificar os defeitos visuais. Este protocolo pode ser adaptado para analisar qualquer das moléculas envolvidas muitas vezes altamente conservadas em polaridade epitelial, biogênese de membrana, tubo e lúmen morfogênese.

Introdução

A geração de celulares e subcellular assimetrias, tais como a formação dos domínios de membrana polarizada, é crucial para a função de células, tecidos e órgãos¹e morfogênese. Estudos sobre biogênese de membrana polarizada em epitélios permanecem um desafio técnico, uma vez que mudanças direcionais na alocação de componentes subcelulares dependem de múltiplos consecutivos e coincidentes extracelulares e intracelulares sinais que são é difícil separar na maioria de modelos e fortemente dependem do sistema de modelo. O modelo apresentado aqui - a camada única Caenorhabditis elegans intestino - é um tecido de requintada simplicidade. Junt....