El Canal de Excretory C. elegans como modelo de morfogénesis Lumen intracelular y En Vivo biogénesis de la membrana polarizada en una sola celda: etiquetado por fusiones de GFP, ARNi interacción pantalla e imagen
Summary
El canal excretor de C. elegans es un modelo único de celular solo para el análisis visual en vivo de la biogénesis de la membrana de nuevo polarizado. Este protocolo describe una combinación de genético estándar/ARNi y enfoques, adaptables para la identificación y caracterización de moléculas dirección tubulogenesis unicelulares y biogénesis de la membrana y lumen apical la proyección de imagen.
Abstract
Los cuatro canales excretores de C. elegans son tubos estrechos que se extendió por la longitud del animal de una sola célula, con casi igual ahora extendido endotubes intracelular que construir y estabilizar la luz con una membrana y submembraneous citoesqueleto de carácter apical. La célula excretora amplía su longitud aproximadamente 2.000 veces para generar estos canales, haciendo este modelo único para la evaluación en vivo de de novo polarizado biogénesis de la membrana, morfogénesis lumen intracelular y unicelulares tubulogenesis. El protocolo que presentamos muestra cómo combinar la norma de etiquetado, ganancia y pérdida-de-función genética o ARN de interferencia (ARNi)-y métodos microscópicos para utilizar este modelo para diseccionar visualmente y funcionalmente analizar estos procesos a nivel molecular. Como un ejemplo de un enfoque de etiquetado, el protocolo describe la generación de animales transgénicos con proteínas fluorescentes de fusión para el análisis directo de tubulogenesis. Como un ejemplo de un enfoque genético, destaca puntos clave de una visual basada en RNAi interacción pantalla diseñada para modificar un fenotipo canal enquistada de ganancia de función. Los métodos específicos descritos son cómo: etiquetar y visualizar los canales de expresión de proteínas fluorescentes; construcción de una biblioteca específica de RNAi y estrategias ARNi de detección para el análisis molecular de la morfogénesis del canal; evaluar visualmente modificaciones de fenotipos de canal; puntuación por disección microscopía de fluorescencia; componentes subcelulares canal a resolución mayor se caracterizan por microscopía confocal; y cuantificar parámetros visuales. El enfoque es útil para el investigador que está interesado en aprovechar el canal excretor de C. elegans para la identificación y caracterización de genes implicados en los procesos filogenéticamente conservados del lumen intracelular y unicelulares morfogénesis del tubo.
Introduction
Todos los órganos internos están compuestos por tubos, cruciales para sus muchas funciones diferentes, tales como el transporte y el intercambio de gases, líquidos y nutrientes y la excreción de desechos metabólicos. Su carácter polarizado, con distintas membranas apicales lumenal, está adaptada a estas funciones específicas, y los defectos en la biogénesis de sus sistemas de endo – y de la membrana plasmática son una causa frecuente de enfermedad humana1,2. La mayoría de los tubos de la vasculatura y de órganos internos es multicelular y forma un lumen intracelular; sin embargo, tubos unicelulares, que forman el lumen intracelular, por ejemplo, pueden representar tanto como 30-50% de camas de tubo capilar humana2. Las membranas polarizadas de multi – y tubos unicelulares son similares en composición, aunque su microdominios pueden variar en base a la función específica del tubo (por ejemplo, canalículos excretores canal versus las microvellosidades intestinales en Caenorhabditis elegans de; Ver acompañando a papel en tubulogenesis intestinal C. elegans )3. Los principios de la biogénesis de la membrana polarizada y tubulogenesis se conservan entre los metazoos, y una maquinaria molecular similar dirige1,2,4.
El sistema excretor de C. elegans consiste en cinco células: la célula excretora (EC), célula del conducto (DC), poro (PC) de la célula y dos células de la glándula. Ablación de la CE, la DC o la PC causa acumulación de líquido en la cavidad del cuerpo y lo animales mueren a una temprana etapa larvaria5. Curiosamente, estos tres tubos unicelulares crean sus lúmenes de tres maneras diferentes: por célula de vaciamiento (CE); envoltura celular junto con la formación de la ensambladura de autocellular (PC); y por la envoltura de la célula junto con autofusion (DC); diferentes mecanismos de la morfogénesis de la luz que los filogenéticamente conservados6,7. La CE, situada en el lado lateral izquierdo del bulbo faríngeo posterior, envía dos extensiones laterales de que los cuatro canales se ramifican para ampliar anterior y posteriormente (en el lado derecho e izquierdo) a la punta de la nariz del gusano y cola , respectivamente (figura 1)5,6,8. La CE se extiende de aproximadamente 1 μm a 2 x 1.000 μm, lo que es la célula más grande en el animal. A nivel subcelular, el conducto excretor es un tubo simple, generado a partir de una membrana basal hacia el pseudocoelom y canalizado por una membrana lumenal (endotube). La membrana lumenal de canal se conecta a la membrana lumenal de conductos en su unión sólo intercelular; los canales son de otra manera junctionless a lo largo de su longitud (figura 1). La membrana lumenal de conducto excretor y su citoesqueleto de submembraneous son apicales, definidos por su composición molecular que se asemeja a la composición de la membrana apical y citoesqueleto de submembraneous de tubos pluricelulares, como el intestino, y de otros epitelios (por ejemplo, planos). Orgánulos citoplásmicos, incluyendo endosomal vesicular y otros (p. ej., Golgi) endomembranas se distribuyen a lo largo de la longitud del canal. Además, múltiples vesículas con canalículos – conectado a la membrana del lumenal, o interconectados o aislados – se roscan a través del canal citoplasma7,8,9,10 . Esta conexión con plasma-membrana/canalículos dinámica más amplía sistema de membrana del canal y contribuye a ambos lumen morfogénesis y osmoregulación10. El canal excretor así consiste casi enteramente de endo – y las membranas de plasma, proporcionando un excelente modelo para el análisis de la biogénesis de la membrana polarizada y la regulación de la endo-interfaz de la membrana plasmática. La dramática expansión de la membrana apical durante la morfogénesis de la canal – en este sistema unicelular coincidente con la extensión de la luz – también permite para analizar los problemas arquitectónicos que se presenta por la necesidad de estabilizar y una membrana intracelular del lumenal del centro . Este protocolo se centra en el análisis de la morfogénesis estructural canal tubo y del lumen y la dinámica de la membrana intracelular necesaria para este proceso en lugar de las señales que dirigen los movimientos celulares que generan posición de la CE en el sistema excretor y sus intrincadas conexiones con otros elementos celulares (revisados en6).
Otra ventaja del sistema de canal sola célula C. elegans para el análisis de membrana polarizada y biogénesis de lumen intracelular es su capacidad para separar, a través del tiempo del desarrollo, la generación de los diferentes componentes de sus membranas y uniones. La CE nace en el momento de cierre ventral y se instala ventro-lateral de la faringe durante mediados embriogénesis5,6,8, durante el cual tiempo canal lateral extensión y ramificación se producen. Esto es seguido por la extensión del canal antero-posterior durante la embriogénesis tardía, un proceso que continúa en la etapa larval L1 (figura 1). En una larva recién eclosionada, la punta posterior alcanza aproximadamente la mitad de la lombriz, completamente que se extiende hasta la cola al final de la fase L1, después el canal se alarga junto con el gusano8. Crecimiento activo de la canal a una velocidad superior a la del crecimiento del animal así termina en la primera etapa larval, sin embargo, más crecimiento se produce en paralelo con el crecimiento del animal entero durante las etapas larvales adicionales (L2-4). Esta configuración proporciona la oportunidad de analizar los diferentes pasos de biogénesis de membrana de novo polarizados independientes de la división de célula polarizada o migración. Además, permite la separación de este proceso desde el montaje de uniones (que ocurren en el embrión antes de la iniciación de lumen); su requisito exacto en la polarización de la membrana es todavía una cuestión abierta en el campo de la polaridad. Por último, únicamente separa apical de expansión de la membrana basal, este último proceso anterior a la anterior en los canales excretores10. El modelo del canal excretor de C. elegans , resulta un complemento especialmente informativo para el modelo intestinal que comparte un número de estas ventajas para el análisis de la biogénesis de la membrana polarizada pero se ejecuta en un entorno multicelular (véase el documento acompañante sobre intestinal tubulogenesis3).
Aunque canales de tipo salvaje son túbulos ultrafinos en este pequeño gusano, sus lúmenes pueden ser visualized directamente por la óptica Nomarski en este animal transparente. De hecho, morfologías del conducto enquistado mutante pueden ser caracterizados en animales sin etiqueta con ampliación baja disección microscopía, que se ha utilizado con gran efecto en adelantados pantallas genéticas para identificar genes implicados en la tubulogenesis11. Mejor visualización de la morfología de canales y distinción de sus membranas polarizados, componentes del citoesqueleto, organelos intracelulares diferentes y otras estructuras subcelulares, sin embargo, requiere de etiquetado y más alto de energía fluorescente microscopía confocal y disección. Aunque estructura fina de los canales plantea una serie de dificultades para el etiquetado y microscopía, membranas y componentes subcelulares pueden distinguirse a través de las moléculas específicas únicas para cada compartimiento, y animales se pueden montar con seguridad para microscopía si ciertas precauciones se toman para evitar la introducción de artefactos (ver Protocolo y discusión). Etiquetado puede hacerse mediante inmunohistoquímica en muestras fijas, o mediante la generación de gusanos transgénicos expresando proteínas fluorescentes de fusión bajo el control de su propia o excretores promotores de canal específicos para proyección de imagen en vivo . Este protocolo describe el etiquetado última técnica (consulte el documento adjunto en tubulogenesis intestinal para el anticuerpo de tinción3).
La capacidad de combinar estudios de pérdida o ganancia de función en vivo en vivo imágenes de análisis en la célula de nivel a lo largo del desarrollo hace el canal excretor de C. elegans un modelo particularmente fuerte para el molecular y Análisis celular de tubulogenesis unicelulares. Avanzar o retroceder pantallas genéticas pueden realizarse a partir de un animal transgénico tipo salvaje o con etiquetado para identificar fenotipos de morfogénesis de canal (por ejemplo, quistes) y sus defectos genéticos subyacentes. Alternativamente, estas pantallas pueden iniciar con un fenotipo mutante (por ejemplo, un conducto enquistado) e identificar supresores o potenciadores de este fenotipo para identificar genes que interactúan funcionalmente con el gene que causa el fenotipo mutante. El defecto genético que causa el fenotipo mutante puede inducir una pérdida (por ejemplo, a través de canceladura del gene) o un aumento (por ejemplo, a través de una mutación activante o a través de la introducción de copias del gen exceso) de la función investigada. Adelante mutagénesis o ARNi sistemática pantallas sin ideas preconcebidas sobre la función del gen y permitan la identificación objetiva de los genes implicados en la función de interés. Teniendo en cuenta la disponibilidad de genoma-ancha de RNAi alimentación bibliotecas, casi cada gen puede ser fácilmente derribado por RNAi en la C. elegans, tal que cualquier solo gen de interés o de cualquier grupo de genes (por ejemplo, en pantallas específicas) puede también ser rápidamente sondeado por su efecto en un enfoque de genética reversa. Para demostrar una posible combinación de enfoques, aquí describimos una pantalla específica de interacción ARNi, a partir de un mutante del canal excretor enquistada de ganancia de función, con proteína fluorescente citoplásmico canal verde (GFP). El fenotipo mutante se generó por la sobreexpresión de erm-1, un altamente conservados C. elegans ortholog de la familia de vinculador de membrana-actina Ezrin-Radixin-moesina (ERM), que ha sido implicada en la morfogénesis de la luz y la membrana organización en muchas especies12. C. elegans ERM-1 se localiza en membranas lumenal de órganos internos, como el canal excretor y el intestino y es necesario para la formación del lumen en ambos13. Sobreexpresión de ERM-1 recluta a actina exceso y vesículas a la membrana lumenal de canal, aumentar el flujo en el lumen y la generación de un corto canal enquistado y una membrana lumenal prensada con actina engrosada capa9. El protocolo describe cómo generar cepas transgénicas con expresa de canal excretor etiquetado como proteínas de fusión (u otras proteínas); Cómo hacer pantallas de ARNi dirigidas a partir de dichas cepas, para identificar los modificadores del fenotipo de un canal; y cómo analizar visualmente los resultados de tales pantallas por microscopía confocal y disección de fluorescencia, incluyendo formas sencillas de cuantificar los fenotipos tubulogenesis informativo. Alternativa etiquetado técnicas y los detalles de RNAi, ajustado a los genes tubulogenesis a menudo letal, puede encontrarse en el documento de acompañamiento en la tubulogenesis intestinal3. Todos los métodos se pueden utilizar en varias combinaciones para la investigación de otras preguntas en el canal tubulogenesis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Versatilidad genética de C. elegans , transparencia, plan de cuerpo simple y linaje de la célula de referencia hacen un excelente modelo para el análisis de la morfogénesis. Este protocolo describe cómo combinar manipulación genética estándar e imagen estudios para tomar ventaja de los 2 micrones delgado canales excretores C. elegans para estudiar la membrana polarizada y biogénesis de lumen intracelular en un tubo de la célula.
Etiquetado
Los ca…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a M. Buechner (Universidad de Kansas, Kansas, EEUU), K. Nehrke (centro médico de la Universidad de Rochester, Rochester, Nueva York, Estados Unidos) y el centro de genética de Caenorhabditis , financiado por los institutos nacionales de salud, oficina de infraestructura de investigación Programas (P40 OD010440). Este trabajo fue financiado por subvenciones NIH GM078653, MGH es 224570 223809 SAA a V.G.
Materials
| Cloning | |||||
| Plasmid pPD95.75 | Addgene | Cat. No. 37464 | |||
| PCR Kit | Qiagen | Cat. No. 27106 | |||
| Ligation kit | New England Biolabs | Cat. No. E2611L | |||
| DNA marker | Thermo Scientific | Cat. No. SM1331 | |||
| Agarose DNA grade | Fisher Scientific | Cat. No. BP164-100 | |||
| Competent cells | New England Biolabs | Cat. No. C2987H | |||
| Tris | Fisher Scientific | Cat. No. BP154-1 | |||
| EDTA | Sigma | Cat. No. ED-1KG | |||
| Acetic acid | Fisher Scientific | Cat. No. A38S-500 | |||
| Ethidium bromide | Fisher Scientific | Cat. No. BP1302-10 | |||
| Equipments | |||||
| PCR machine | MJ Research | Cat. No. PTG-200 | |||
| Centrifuge | Eppendorf | Cat. No. 5415C | |||
| Water Bath | Precision Scientific | Cat. No. 666A3 | |||
| Gel running instrument | Fisher Scientific | Cat. No. 09-528-165 | |||
| Gel running power supply | Fisher Scientific | Cat. No. 45-000-465 | |||
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | Cat. No. 1708195EDU | |||
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | Cat. No. ND1000 | |||
| C. elegans related1 | 1see reference27 for standard C. elegans culture and maintenance procedures. | ||||
| LB Medium and plates2 | 2see reference24 for protocols. | ||||
| Tryptone | Acros Organics | Cat. no. 611845000 | |||
| Yeast Extract | BD Biosciences | Cat. no. 212750 | |||
| NaCl | Sigma | Cat. no. S7653 | |||
| Bacto Agar | BD Biosciences | Cat. no. 214040 | |||
| Ampicillin | Sigma | Cat. no. A0116 | |||
| Tetracycline | Fisher Scientific | Cat. no. BP912 | |||
| M9 Medium2 | 2see reference24 for protocols. | ||||
| NaCl | Sigma | Cat. no. S7653 | |||
| KH2PO4 | Sigma | Cat. no. P0662 | |||
| Na2HPO4 | Sigma | Cat. no. S7907 | |||
| MgSO4 | Sigma | Cat. no. M2773 | |||
| NGM plates 2 | 2see reference24 for protocols. | ||||
| NaCl | Sigma | Cat. no. S7653 | |||
| Peptone | BD Biosciences | Cat. no. 211677 | |||
| Tryptone | Acros Organics | Cat. no. 611845000 | |||
| Bacto Agar | BD Biosciences | Cat. no. 214040 | |||
| MgSO4 | Sigma | Cat. no. M2773 | |||
| CaCl2 | Sigma | Cat. no. C3881 | |||
| Cholesterol | Sigma | Cat. no. C8667 | |||
| K2HPO4 | Sigma | Cat. no. P3786 | |||
| KH2PO4 | Sigma | Cat. no. P0662 | |||
| RNAi plates3 | 3see reference60 for protocols. | ||||
| NaCl | Sigma | Cat. no. S7653 | |||
| Peptone | BD Biosciences | Cat. no. 211677 | |||
| Tryptone | Acros Organics | Cat. no. 611845000 | |||
| Bacto Agar | BD Biosciences | Cat. no. 214040 | |||
| MgSO4 | Sigma | Cat. no. M2773 | |||
| CaCl2 | Sigma | Cat. no. C3881 | |||
| Cholesterol | Sigma | Cat. no. C8667 | |||
| K2HPO4 | Sigma | Cat. no. P3786 | |||
| KH2PO4 | Sigma | Cat. no. P0662 | |||
| IPTG | US Biological | Cat. no. I8500 | |||
| Carbenicillin | Fisher Scientific | Cat. no. BP2648 | |||
| NaOH | Fisher Scientific | Cat. no. SS266-1 | |||
| Sodium hypochlorite | Fisher Scientific | Cat. no. 50371500 | |||
| Bacteria | |||||
| OP50 bacteria | CGC | ||||
| HT115 bacteria | CGC | ||||
| Genome-wide RNAi libraries | |||||
| Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref29,49) | Source BioScience | ||||
| C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref50) | Source BioScience | ||||
| Imaging related | |||||
| Lidocaine | MP Biomedicals,LLG | Cat. no. 193917 | |||
| Materials | |||||
| Vacuum Grease Silicone | Beckman | Cat. no. 335148 | |||
| Microscope slides | Fisher Scientific | Cat. no. 4448 | |||
| Microscope coverslips (22×22-1） | Fisher Scientific | Cat. no. 12-542-B | |||
| Tissue culture plate, 6 well | Corning Inc. | Cat. no. 08-772-33 | |||
| Equipment | |||||
| SMZ-U dissecting microscope (Nikon) | |||||
| SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions). | |||||
| TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem) | |||||
| C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon) | |||||
Referências
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