O Canal de Excretory c. elegans como modelo para intracelular Lumen morfogênese e Vivo na biogênese de membrana polarizada em uma única célula: rotulagem por GFP-fusões, tela de interação de RNAi e Imaging

Nan Zhang; Edward Membreno; Susan Raj; Hongjie Zhang; Liakot A Khan; Verena Gobel

doi:10.3791/56101

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Artigo de método

O Canal de Excretory c. elegans como modelo para intracelular Lumen morfogênese e Vivo na biogênese de membrana polarizada em uma única célula: rotulagem por GFP-fusões, tela de interação de RNAi e Imaging

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DOI:

10.3791/56101

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3 de outubro de 2017

Nan Zhang¹^,² , Edward Membreno¹ , Susan Raj¹ , Hongjie Zhang¹^,³ , Liakot A Khan¹ , Verena Gobel¹

¹Mucosal Immunology and Biology Research Center, Developmental Biology and Genetics Core, Massachusetts General Hospital for Children, Harvard Medical School, ²College of Life Sciences, Jilin University, ³Faculty of Health Sciences, University of Macau

Neste artigo

Resumo

O canal excretor de c. elegans é um exclusivo modelo de célula única para a análise visual na vivo de biogênese de membrana de novo polarizada. Este protocolo descreve uma combinação de padrão genético/RNAi e abordagens, adaptávelas para a identificação e caracterização de moléculas dirigindo tubulogenesis unicelulares e apical da membrana e lúmen biogênese de imagem.

Resumo

Os quatro canais excretores de c. elegans são tubos estreitos estendidos através do comprimento do animal, de uma única célula, com quase igualmente longe estendido endotubes intracelular que construir e estabilizar o lúmen com uma membrana e submembraneous citoesqueleto de caráter apical. Excretor célula expande seu comprimento aproximadamente 2.000 vezes para gerar esses canais, fazendo com que este modelo exclusivo para a avaliação na vivo de biogênese de membrana de novo polarizada, morfogênese lúmen intracelular e unicelulares tubulogenesis. O protocolo apresentado aqui mostra como combinar o padrão de rotulagem, ganho e perda-de-função genética ou RNA de interferência (RNAi)-e abordagens microscópicas usar este modelo para dissecar visualmente e funcionalmente analisar esses processos em um nível molecular. Como um exemplo de uma abordagem de rotulagem, protocolo descreve a geração de animais transgénicos com proteínas da fusão fluorescente para análise ao vivo de tubulogenesis. Como um exemplo de uma abordagem genética, destaca pontos-chave de uma tela de interação baseada em RNAi visual projetado para modificar um fenótipo de ganho-de-função canal cístico. Os métodos específicos descritos são como: etiqueta e visualizar os canais expressando proteínas fluorescentes; construir uma biblioteca de alvo RNAi e strategize RNAi triagem para a análise molecular da morfogênese de canal; visualmente, avaliar as modificações dos fenótipos de canal; Pontuação deles dissecando a microscopia de fluorescência; caracterizar componentes subcelulares canal com resolução mais alta pela microscopia confocal; e quantificar parâmetros visuais. A abordagem é útil para o investigador que está interessado em aproveitar o canal excretor de c. elegans para identificar e caracterizar os genes envolvidos nos processos filogeneticamente conservados de lúmen intracelular e unicelulares morfogênese de tubo.

Introdução

Todos os órgãos internos são compostos de tubos, cruciais para suas muitas funções diferentes, tais como o transporte e a troca de gases, líquidos e nutrientes e a excreção de resíduos metabólicos. Seu caráter polarizado, com distintas membranas apicais e lumenal, é adaptado para essas funções específicas, e defeitos na biogênese dos seus sistemas de endo - e membrana plasmática são uma causa frequente de doença humana¹^,². A maioria dos tubos da vasculatura e dos órgãos internos é pluricelulares e forma um lúmen intercellularly; no entanto, tubos unicelulares, que formam o lúmen intracelular, podem, por exempl....