قناة Excretory C. ايليجانس كنموذج ل Morphogenesis التجويف داخل الخلايا و في فيفو الاستقطاب نشوء غشاء حيوي في "خلية واحدة": وضع العلامات بالتجارة والنقل-الأنشطار والشاشة التفاعل [رني] والتصوير

Summary

القناة C. ايليجانس مطرح نموذج خلية واحدة فريدة من نوعها لتحليل البصرية في فيفو نشوء حيثياته استقطاب غشاء حيوي. ويصف هذا البروتوكول مزيجاً من القياسي الوراثية/[رني] والتصوير النهج، قابلة للتكيف لتحديد وتوصيف جزيئات توجيه أحادي الخلية توبولوجينيسيس، ونشوء حيوي الغشاء والتجويف قمي.

Abstract

هي القنوات مطرح C. ايليجانس أربعة أنابيب ضيقة تمتد من خلال طول الحيوان من خلية واحدة، بالتساوي تقريبا الآن الموسعة اندوتوبيس داخل الخلايا بناء واستقرار التجويف بالغشاء وسوبميمبرانيوس سيتوسكيليتون حرف قمي. يوسع الخلية مطرح طوله حوالي ألفي لتوليد هذه القنوات، مما يجعل هذا النموذج الفريد للتقييم في فيفو لنشوء حيثياته استقطاب غشاء حيوي، morphogenesis التجويف داخل الخلايا وأحادي الخلية توبولوجينيسيس. البروتوكول المعروضة هنا يوضح كيفية الجمع بين معيار العلامات، الربح والخسارة-من-وظيفة الوراثية أو الحمض النووي الريبي التدخل ([رني])-، والنهج المجهري لاستخدام هذا النموذج لتشريح بصريا ووظيفيا تحليل هذه العمليات على مستوى جزيئي. كمثال على نهج وضع العلامات، يحدد البروتوكول توليد الحيوانات المحورة وراثيا مع البروتينات الفلورية الانصهار لتحليل العيش من توبولوجينيسيس. كمثال على نهج الوراثية، يسلط الضوء على النقاط الرئيسية من الشاشة المرئية التفاعل القائم على [رني] تهدف إلى تعديل النمط الظاهري قناة الكيسي مكسب للدالة. أساليب محددة ووصف كيفية: التسمية ووضع تصور للقنوات بالتعبير عن البروتينات الفلورية؛ بناء مكتبة [رني] مستهدفة، ووضع استراتيجية [رني] فحص للتحليل الجزيئي للقناة morphogenesis؛ تقييم بصريا التعديلات لتعمل القناة؛ نقاط لهم بتشريح مجهرية الأسفار؛ وصف مكونات القناة سوبسيلولار دقة أعلى بالفحص المجهري [كنفوكل]؛ والتحديد الكمي للمعلمات البصرية. النهج مفيد للمحقق الذي يرغب في الاستفادة من القناة C. ايليجانس مطرح لتحديد ووصف الجينات المتورطين في عمليات فيلوجينيتيكالي مصانة في التجويف داخل الخلايا وأحادي الخلية أنبوب morphogenesis.

Introduction

جميع الأجهزة الداخلية تتكون من أنابيب، حاسمة بالنسبة للعديد من وظائفها المختلفة، مثل النقل وتبادل الغازات والسوائل والمواد المغذية وإفراز النفايات الأيضية. طابعها الاستقطاب، مع الأغشية قمي ولومينال متميزة، هو تكييف هذه المهام المحددة، والعيوب في نشوء حيوي نظمها إندو-وغشاء البلازما سبب كثرة الأمراض البشرية^1،2. معظم الأنابيب المفرج والأجهزة الداخلية متعددة الخلايا وتشكل من تجويف إينتيرسيلولارلي؛ بيد أن يمكن، على سبيل المثال، تمثل أنابيب أحادي الخلية، التي تشكل التجويف إينتراسيلولارلي، بقدر ما 30 – 50% من البشرية الشعرية الأسرة². أغشية الاستقطاب المتعدد الأطراف وأنابيب أحادي الخلية متشابهة في تكوينها، على الرغم من أن هذه ميكرودوماينس قد تختلف استناداً إلى أنبوب وظيفة معينة (مثلاً، كاناليكولي قناة مطرح مقابل زغيبات الأمعاء في كاينورهابديتيس ايليجانس؛ انظر المصاحبة للورقة على توبولوجينيسيس المعوية C. ايليجانس )³. يتم المحافظة عليها مبادئ نشوء الاستقطاب غشاء حيوي وتوبولوجينيسيس بين ميتازوانس، ويوجه إليه جزيئية مماثلة لهم^1،،من²⁴.

C. ايليجانس مطرح تتألف من خمس خلايا: خلية مطرح (الجماعة الأوروبية)، خلية لاصق (DC)، المسام خلية (PC) واثنين من خلايا الغدة. الاجتثاث من المفوضية الأوروبية، DC أو الكمبيوتر يسبب تراكم السائل في تجويف الجسم ويموت الحيوانات مرحلة يرقات مبكر⁵. الفضول، إنشاء هذه الأنابيب أحادي الخلية ثلاثة بهم لومن بثلاث طرق مختلفة: بخلية تفريغ (EC)؛ الخلية التفاف مقترنة بتشكيل تقاطع أوتوسيلولار (PC)؛ وقبل التفاف الخلية مقرونا أوتوفوسيون (DC)؛ آليات مختلفة من morphogenesis التجويف التي حفظت فيلوجينيتيكالي^6،كل⁷. المفوضية الأوروبية، يقع في الجهة الجانبية اليسرى من لمبة البلعوم الخلفي، يرسل امتدادات جانبية اثنين من التي تتفرع القنوات الأربع تمتد إلى الأسفل والخلف (في كل من الجانب الأيمن والأيسر) غيض من الآنف دودة والذيل ، على التوالي (الشكل 1)^5،،من⁶⁸. المفوضية الأوروبية يمتد من حوالي 1 ميكرون إلى 2 x 1,000 ميكرومتر، مما يجعلها أكبر الخلية في الحيوان. على مستوى سوبسيلولار، القناة مطرح أنبوب بسيط، المتولدة من غشاء القاعدي توجه بسيودوكولوم، ونفق بغشاء لومينال (اندوتوبي). غشاء لومينال قناة تتصل بغشاء لاصق لومينال على مفترق طرق بين الخلايا فقط؛ وإلا القنوات جونكتيونلس على طول أطوال (الشكل 1). غشاء لومينال قناة مطرح وما سيتوسكيليتون سوبميمبرانيوس قمي، حددها التركيب الجزيئي يشبه تكوين غشاء قمي وسيتوسكيليتون سوبميمبرانيوس من أنابيب متعددة الخلايا، مثل الأمعاء، ومن ابيثيليا الأخرى (مثلاً، شقة). هيولى العضيات، بما في ذلك اندوسومال حويصلية وأخرى (مثلاً، غولجي) توزع اندوميمبرانيس على طول القناة. وبالإضافة إلى ذلك، تكون مترابطة متعددة الحويصلات كاناليكولار-أما متصلة بغشاء لومينال، و/أو مترابطة، أو معزولة-من خلال قناة السيتوبلازم^7،،من^89،10 . هذا الصدد البلازما-غشاء/كاناليكولار الحيوية كذلك توسع نظام غشاء القناة ويساهم كلا التجويف morphogenesis وأوسموريجوليشن¹⁰. وهكذا يتكون القناة مطرح كلياً تقريبا من إندو-والأغشية البلازمية، تقديم نموذج ممتاز لتحليل نشوء حيوي غشاء الاستقطاب وتنظيم إندو-إلى واجهة غشاء البلازما. توسعا هائلا من غشاء قمي خلال القناة morphogenesis-في هذا النظام خلية واحدة تزامنت مع ملحق التجويف – يسمح أيضا لتحليل المشاكل المعمارية الناشئة بالحاجة إلى تحقيق الاستقرار ومركز غشاء لومينال داخل الخلايا . ويركز هذا البروتوكول على تحليل morphogenesis الهيكلية القناة الأنبوب وفي التجويف وديناميات غشاء داخل الخلايا المطلوبة لهذه العملية بدلاً من الإشارات التي توجه حركة الخلية التي تولد موقف المفوضية الأوروبية في نظام مطرح وتشييد صلاتها المعقدة إلى العناصر الخلوية الأخرى (استعرض في⁶).

وثمة ميزة أخرى للنظام قناة وحيدة الخلية C. ايليجانس للتحليل الغشاء الاستقطاب ونشوء حيوي التجويف داخل الخلايا هو قدرته على فصل، عبر الزمن التنموية، جيل مكونات مختلفة في الأغشية والوصلات. المفوضية الأوروبية هو ولد في وقت الإغلاق البطني ويستقر فينترو أفقياً من البلعوم خلال منتصف embryogenesis^5،،من⁶⁸، تحدث خلالها تمديد الوقت القناة الجانبية والتفريع. هذا هو متبوعة تمديد قناة الأمامي الخلفي خلال أواخر embryogenesis، عملية التي ما زالت في مرحلة اليرقات L1 (الشكل 1). يرقة فقست حديثا، الحافة الخلفية قناة تصل إلى حوالي منتصف الدودة، تماما توسيع للذيل في نهاية المرحلة L1، بعد الوقت الذي القناة الغضروفي جنبا إلى جنب مع دودة⁸. قناة نشطة في النمو بسرعة تفوق نمو الحيوان وهكذا ينتهي في مرحلة اليرقات الأولى، إلا أن زيادة النمو يحدث بالتوازي مع نمو الحيوان كله خلال مراحل اليرقات إضافية (L2 – 4). يوفر هذا الإعداد الفرصة لتحليل الخطوات المختلفة لنشوء حيثياته استقطاب غشاء حيوي مستقلة عن انقسام الخلية الاستقطاب أو الهجرة. وعلاوة على ذلك، فهو يسمح الفصل بين هذه العملية من الجمعية للوصلات (التي تحدث في الجنين قبل الشروع في التجويف)؛ شرط الضبط في استقطاب الغشاء لا تزال مسألة مفتوحة في مجال الأقطاب. وأخيراً، فإنه فريد يفصل قمي من توسع الغشاء القاعدي، العملية الأخيرة السابقة السابقة في القنوات مطرح¹⁰. نموذج القناة مطرح C. ايليجانس هو ذلك تكملة مفيدة خاصة لنموذج المعوية التي أسهم عدد من هذه المزايا لتحليل نشوء الاستقطاب غشاء حيوي ولكن تنفيذ ذلك في بيئة متعددة الخلايا (انظر الورقة المرفقة على توبولوجينيسيس المعوية³).

على الرغم من أن القنوات البرية من نوع سامسونج الأنابيب في هذا دودة صغيرة، لومن بهم يمكن أن يكون السادسسواليزيد مباشرة من بصريات نومارسكي في هذا الحيوان شفافة. وفي الواقع، يمكن أن توصف مورفولوجيس قناة الكيسي المسخ في الحيوانات غير مسمى باستخدام التكبير المنخفض تشريح مجهرية، التي استخدمت لتأثير كبير في شاشات الجينية إلى الأمام لتحديد الجينات المشتركة في توبولوجينيسيس¹¹. التصور تحسين مورفولوجية الترع والتمييز على الأغشية الاستقطاب ومكونات سيتوسكيليتال، العضيات داخل الخلايا المختلفة والهياكل الأخرى سوبسيلولار، ومع ذلك، يتطلب وضع العلامات وأعلى السلطة فلوري مجهر تشريح و [كنفوكل]. على الرغم من أن هيكل غرامة على القنوات يطرح عددا من الصعوبات لوضع العلامات والفحص المجهري، يمكن التمييز بين الأغشية ومكونات سوبسيلولار عن طريق جزيئات معينة فريدة من نوعها لكل حجرة، ويمكن تركيبة الحيوانات بأمان للفحص المجهري إذا وتتخذ احتياطات معينة لتجنب إدخال الفنية (انظر البروتوكول و المناقشة). وضع العلامات يمكن القيام به إيمونوهيستوتشيميستري في عينات ثابتة أو بتوليد الديدان المعدلة وراثيا معربا عن البروتينات الفلورية الانصهار تحت سيطرة الخاصة بهم أو مطرح المروجين قناة خاصة للتصوير في فيفو . يصف هذا الأسلوب وصفها الأخير من هذا البروتوكول (انظر الورقة المرفقة على توبولوجينيسيس المعوية لجسم تلطيخ³).

مستوى القدرة على الجمع بين الدراسات في فيفو الخسارة أو الربح-من-وظيفة في فيفو التصوير التحليل في خلية واحدة فقط في جميع أنحاء يجعل التنمية القناة مطرح C. ايليجانس نموذج قوي بصفة خاصة الجزيئية و تحليل الخلوية توبولوجينيسيس أحادي الخلية. يمكن أن يؤديها إلى الأمام أو عكس شاشات الجينية بدءاً الحيوانات المحورة وراثيا البرية من نوع أو المسمى لتحديد قناة morphogenesis تعمل (على سبيل المثال، الخراجات) وبها عيوب الجينات الكامنة. بدلاً من ذلك، هذه الشاشات يمكن أن تبدأ النمط الظاهري المسخ (مثلاً، قناة الكيسي) وتحديد المكثفات أو محسنات من هذا النمط الظاهري لتحديد الجينات وظيفيا تتفاعل مع الجينات تسبب النمط الظاهري متحولة. العيب الوراثي مما تسبب في النمط الظاهري المسخ يمكن أن يستحث مكسب أو خسارة (مثلاً، عن طريق حذف الجينات) (مثلاً، عن طريق الطفرات تفعيل أو عن طريق الأخذ بنسخ الجينات الزائدة) وظيفة التحقيق. إلى الأمام الطفرات أو منهجي [رني] شاشات دون أفكار مسبقة حول وظيفة الجينات وتسمح بتحديد الجينات المتورطين في وظيفة الفائدة غير متحيزة. نظراً لتوفر تغذية المكتبات [رني] على نطاق الجينوم، تقريبا كل الجينات يمكن أن تكون بسهولة ترسيتها قبل [رني] في C. ايليجانس، مثل أن أي مورثة واحدة من الاهتمام أو أي مجموعة من الجينات (مثلاً، في الشاشات المستهدفة) يمكن أيضا أن تكون سرعة سبر لأثرها في نهج علم الوراثة عكسي. وللتدليل على مزيج ممكن من النهج، نحن هنا وصف شاشة تفاعل [رني] مستهدفة، بدءاً متحولة قناة مطرح الكيسي مكسب للدالة، المسمى بروتين فلوري هيولى قناة الأخضر (التجارة والنقل). النمط الظاهري المسخ تم إنشاؤها بواسطة overexpression من إدارة مخاطر المؤسسات-1، الغاية مصانة C. ايليجانس أورثولوج الأسرة رابط غشاء-أكتين Ezrin-راديكسين-موسين (ERM)، الذي كان متورطا في التجويف morphogenesis والغشاء المنظمة في العديد من الأنواع¹². C. ايليجانس ERM-1 يموضع للأغشية لومينال أجهزة الداخلية، مثل قناة مطرح والأمعاء، وهو مطلوب لتشكيل التجويف في كلا¹³. إدارة مخاطر المؤسسات-1 overexpression المجندين أكتين الزائدة وحويصلات للغشاء لومينال القناة، زيادة الجريان في التجويف وتوليد قناة الكيسي قصيرة وغشاء لومينال مجعد مع الأكتين سميكة الفروة⁹. البروتوكول توضح كيفية توليد سلالات معدلة وراثيا مع مطرح أعرب عن قناة المسمى الانصهار البروتينات (أو غيرها من البروتينات)؛ كيفية أداء شاشات [رني] مستهدفة بدءاً من هذه الضغوط، لتحديد المعدلات النمط الظاهري القناة؛ وكيفية تحليل نتائج هذه الشاشات بصريا بالفحص المجهري تشريح و [كنفوكل] الأسفار، بما في ذلك طرق بسيطة لقياس تعمل توبولوجينيسيس غنية بالمعلومات. يمكن الاطلاع على البديل العلامات تقنيات والتفاصيل [رني], تعديل الجينات توبولوجينيسيس قاتلة في كثير من الأحيان، في الورقة المرفقة بشأن توبولوجينيسيس المعوية³. يمكن استخدام كافة الأساليب في توليفات مختلفة لتحقيق مسائل أخرى على قناة توبولوجينيسيس.

Protocol

1-تسمية القناة Excretory C. ايليجانس “الفلورسنت الانصهار البروتينات” 14 ملاحظة: انظر الورقة المرفقة على توبولوجينيسيس المعوية 3 لوضع العلامات التي في الموقع الضد تلطيخ إجراءات قابلة للتكيف للقناة مطرح. انظر الجدول 1 للاطلاع على أمثلة …

Representative Results

هذا البروتوكول يصف كيفية استخدام القنوات مطرح C. ايليجانس بصريا وجزيئيا تحليل أحادي الخلية توبولوجينيسيس و morphogenesis التجويف داخل الخلايا في خلية واحدة. أثناء تمديد الفترة من منتصف امبريوجينيسيس إلى مرحلة البلوغ، أربع قنوات مطرح الاستمرار في توسيع باسولاتيرال والأغ?…

Discussion

C. ايليجانس التنوع الوراثي، والشفافية وخطة الهيئة بسيطة ونسب ثابتة من خلية جعله نموذجا رائعا لتحليل morphogenesis. هذا البروتوكول ويصف كيفية الجمع بين التلاعبات الجينية القياسية وتصوير دراسات للاستفادة من ميكرون 2 رقيقة C. ايليجانس القنوات مطرح دراسة الغشاء الاستقطاب ونشوء حيوي التجو?…

Materials

Cloning
Plasmid pPD95.75	Addgene	Cat. No. 37464
PCR Kit	Qiagen	Cat. No. 27106
Ligation kit	New England Biolabs	Cat. No. E2611L
DNA marker	Thermo Scientific	Cat. No. SM1331
Agarose DNA grade	Fisher Scientific	Cat. No. BP164-100
Competent cells	New England Biolabs	Cat. No. C2987H
Tris	Fisher Scientific	Cat. No. BP154-1
EDTA	Sigma	Cat. No. ED-1KG
Acetic acid	Fisher Scientific	Cat. No. A38S-500
Ethidium bromide	Fisher Scientific	Cat. No. BP1302-10
Equipments
PCR machine	MJ Research	Cat. No. PTG-200
Centrifuge	Eppendorf	Cat. No. 5415C
Water Bath	Precision Scientific	Cat. No. 666A3
Gel running instrument	Fisher Scientific	Cat. No. 09-528-165
Gel running power supply	Fisher Scientific	Cat. No. 45-000-465
Molecular Imager Gel Doc XR System	Bio-Rad	Cat. No. 1708195EDU
Nanodrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	Cat. No. ND1000
C. elegans related1			1see reference27 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates2			2see reference24 for protocols.
Tryptone	Acros Organics	Cat. no. 611845000
Yeast Extract	BD Biosciences	Cat. no. 212750
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
Bacto Agar	BD Biosciences	Cat. no. 214040
Ampicillin	Sigma	Cat. no. A0116
Tetracycline	Fisher Scientific	Cat. no. BP912
M9 Medium2					2see reference24 for protocols.
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
KH2PO4	Sigma	Cat. no. P0662
Na2HPO4	Sigma	Cat. no. S7907
MgSO4	Sigma	Cat. no. M2773
NGM plates 2			2see reference24 for protocols.
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
Peptone	BD Biosciences	Cat. no. 211677
Tryptone	Acros Organics	Cat. no. 611845000
Bacto Agar	BD Biosciences	Cat. no. 214040
MgSO4	Sigma	Cat. no. M2773
CaCl2	Sigma	Cat. no. C3881
Cholesterol	Sigma	Cat. no. C8667
K2HPO4	Sigma	Cat. no. P3786
KH2PO4	Sigma	Cat. no. P0662
RNAi plates3			3see reference60 for protocols.
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
Peptone	BD Biosciences	Cat. no. 211677
Tryptone	Acros Organics	Cat. no. 611845000
Bacto Agar	BD Biosciences	Cat. no. 214040
MgSO4	Sigma	Cat. no. M2773
CaCl2	Sigma	Cat. no. C3881
Cholesterol	Sigma	Cat. no. C8667
K2HPO4	Sigma	Cat. no. P3786
KH2PO4	Sigma	Cat. no. P0662
IPTG	US Biological	Cat. no. I8500
Carbenicillin	Fisher Scientific	Cat. no. BP2648
NaOH	Fisher Scientific	Cat. no. SS266-1
Sodium hypochlorite	Fisher Scientific	Cat. no. 50371500
Bacteria
OP50 bacteria	CGC
HT115 bacteria	CGC
Genome-wide RNAi libraries
Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref29,49)	Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref50)	Source BioScience
Imaging related
Lidocaine	MP Biomedicals,LLG	Cat. no. 193917
Materials
Vacuum Grease Silicone	Beckman	Cat. no. 335148
Microscope slides	Fisher Scientific	Cat. no. 4448
Microscope coverslips (22×22-1）	Fisher Scientific	Cat. no. 12-542-B
Tissue culture plate, 6 well	Corning Inc.	Cat. no. 08-772-33
Equipment
SMZ-U dissecting microscope (Nikon)
SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions).
TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem)
C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon)