Erzeugung und Langzeitpflege von Nervenfreiheit<em> Hydra</em
Summary
Durch eine doppelte Behandlung mit Colchicin, einem pflanzlichen Toxin, das trennende Zellen tötet, kann nervenfreie Hydra vulgaris erzeugt werden. Diese Hydra können nicht selbst ernähren oder bestochen werden. Dieses Papier beschreibt eine verbesserte Methode zur Langzeitpflege von nervenfreien Hydra vulgaris im Labor.
Abstract
Die interstitielle Zelllinie von Hydra umfasst multipotenten Stammzellen und deren Derivate: Drüsenzellen, Nematocyten, Keimzellen und Nervenzellen. Die interstitiellen Zellen können durch zwei aufeinanderfolgende Behandlungen mit Colchicin, einem pflanzlichen Toxin eliminiert werden, das die Trennzellen tötet, wodurch das Potenzial für die Erneuerung der differenzierten Zellen, die aus den interstitiellen Stammzellen gewonnen werden, gelöscht wird. Dies ermöglicht die Erzeugung von Hydra , die keine Nervenzellen haben. Ein nervenfreier Polypen kann seinen Mund nicht öffnen, um den osmotischen Druck zu ernähren, zu bestrafen oder zu regulieren. Solche Tiere können jedoch überleben und auf unbestimmte Zeit im Labor kultiviert werden, wenn sie regelmäßig zwangsernährt und geplatzt werden. Der Mangel an Nervenzellen ermöglicht die Untersuchung der Rolle des Nervensystems bei der Regulierung des Tierverhaltens und der Regeneration. Bisher veröffentlichte Protokolle für nervenfreie Hydra- Instandhaltung beinhalten veraltete Techniken wie Mundpipettieren mit handgezogener Mikropipette tIps, um die Hydra zu füttern und zu reinigen. Hier wird ein verbessertes Protokoll zur Pflege von nervenfreier Hydra eingeführt. Feinspitzen werden verwendet, um den Mund zu öffnen und frisch getötete Artemia einzusetzen. Nach der Zwangsernährung wird die Körperhöhle des Tieres mit frischem Medium unter Verwendung einer Spritze und einer Injektionsnadel gespült, um unverdautes Material zu entfernen, das hier als "burping" bezeichnet wird. Diese neue Methode der Kraft-Fütterung und Aufstoßen von nervenfreien Hydra durch den Einsatz von Pinzetten und Spritzen beseitigt die Notwendigkeit für Mund-Pipettieren mit handgezogenen Mikropipettenspitzen. Damit ist der Prozess sicherer und deutlich zeitaufwändiger. Um sicherzustellen, dass die Nervenzellen im Hypostom eliminiert wurden, wird die Immunhistochemie unter Verwendung von Anti-Tyrosin-Tubulin durchgeführt.
Introduction
Das Nervensystem von Hydra besteht aus einem Nervennetz, wobei Neuronen mit beiden Epithelgewebeschichten 1 assoziiert sind. Das Nervennetz ist dichter im Hypostom und Stiel und weniger dicht in der Körpersäule 2 . Die Nervenzellen stammen aus interstitiellen Stammzellen, die multipotenten Stammzellen sind, die zu sekretorischen Zellen, Nematocyten, Keimzellen und Neuronen führen. Es ist möglich, die interstitiellen Zellen von Hydra vulgaris durch die Behandlung mit Colchicin 3 , 4 , ein pflanzliches Toxin, das trennenden Zellen zu beseitigen, zu eliminieren. Obwohl Colchicin die Mikrotubulus-Polymerisation in anderen Organismen verhindert hat, hat eine frühere Studie gezeigt, dass Mikrotubuli in Hydra während der gesamten Behandlung vorhanden sind, was darauf hindeutet, dass Colchicin dies nicht in Hydra 3 bewirkt. Ein anderer stUdy schlägt vor, dass Colchicin in einigen Organismen nicht effizient an Tubulin bindet, wie Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas und Schizosaccharomyces pombe, was diesen Unterschied erklären kann 5 . Die Colchicin-Behandlung induziert die Phagozytose der interstitiellen Zellen durch die endodermalen Epithelzellen 3 und ermöglicht somit die Entstehung von Tieren, denen Nervenzellen, Drüsenzellen und Nematocyten fehlen. Es ist unklar, warum die interstitiellen Zellen besonders anfällig für Colchicin-Behandlung sind. Angesichts der Tatsache, dass sowohl post-mitotische interstitielle Zellen als auch die interstitielle Stammzelllinie beschädigt und phagozytiert sind, kam Campbell zu dem Schluss, dass Colchicin die Mitoseaktivität nicht direkt beeinflusst hat 3 . Bemerkenswert ist, dass die Colchicin-Behandlung in Hydra vulgaris gut funktioniert , aber es wurde gezeigt, dass sie auch bei anderen Spezies, wie Hydra oligactis 6 , nicht funktioniert . </Em> Eine modifizierte Behandlung mit Colchicin und Hydroxyharnstoff kann zur Herstellung von nervenfreier Hydra viridis 7 verwendet werden . Nervenfreie Hydra (auch manchmal als "Epithel- Hydra " 8 bezeichnet ) sind daher ein nützliches Hilfsmittel für die Untersuchung der Rollen dieser spezialisierten Zelltypen aus der interstitiellen Zelllinie in Geweihhomöostase und Regeneration.
Hydra kann das einzige bekannte Beispiel eines Tieres sein, das ohne Nervensystem leben kann. Nervenfreie Hydra dienen als besonders nützliches Modell für die Sezierung der Rolle des Nervenetzes bei der Regulierung der Hydra- Regeneration, Homöostase und Verhalten. Zum Beispiel erlaubte die Einführung von interstitiellen Zellen in nervenfreie Hydra über Pfropfen die Charakterisierung der Nervenzelldifferenzierung als hochregionsspezifische 9 . Darüber hinaus, weil nervenfreie Hydra regenerieren können, sieErmöglichen die Untersuchung alternativer, nervensystemunabhängiger Regenerationswege. Ein solches Beispiel ist eine apikale Neurogenese und Kopfbildung, von der gezeigt wurde, dass sie sich auf die cnox-2- Funktion im Nervensystem in Wildtyp- Hydra auswirkt , scheint aber in nervenfreier Hydra entbehrlich zu sein, was darauf hindeutet, dass es einen alternativen Kopfregenerationsprozess geben kann 10
Nervenfreie Hydra wurden auch verwendet, um Epithelzell-Expression und Regulation von neurogenen und Neurotransmission-Genen nach dem Verlust der Neurogenese zu untersuchen 11 . Nervenfreie Hydra zeigen keine spontanen Kontraktionsbursts 12 , was darauf hinweist, dass diese Bursts durch das Nervensystem reguliert werden. Nervenfreie Hydra dagegen verhalten sich als Reaktion auf das Einklemmen der Körpersäule mit Pinzette, was darauf hindeutet, dass die Kontraktion in Reaktion auf mechanische Reize durch Kopplung von Throu vermittelt wirdGh-Spaltübergänge in Epithelzellen, während das spontane kontraktile Verhalten durch Kopplung durch Spaltübergänge in Nervenzellen vermittelt wird 13 .
Nervenfreie Hydra öffnen ihre Münder nicht, wenn sie mit Nahrung oder reduziertem Glutathion 3 versehen sind , was darauf hindeutet, dass sensorische Neuronen notwendig sind, um die Anwesenheit von Nahrung zu erkennen und den Mund zu öffnen, um sich zu öffnen. Darüber hinaus scheint das Nervennetz eine Rolle bei der Erfassung des osmotischen Drucks zu spielen, weil nervenfreie Tiere nicht in der Lage sind, ihren internen hydrostatischen Druck durch die Mundöffnung autonom zu regulieren, wodurch ihr charakteristisches ballonähnliches Aussehen 3 , 4 ( Abbildung 1B ) verursacht wird. Die Regulation des hydrostatischen Drucks in der nervenfreien Hydra durch häufige manuelle Deflation führte zu einem Verlust einer abnormen Morphologie in der Hypostomie und der Körpersäule. Die chronische Deflation führte jedoch zu einer Störung des WachstumsOngation, Knospen und Gewebeorganisation 8 .
Obwohl nervenfreie Hydra nicht in der Lage sind, sich selbst zu ernähren und zu ewigen, ist es möglich, sie unbegrenzt im Labor zu pflegen, indem man jedes Tier manuell zwangsernährt und zerbricht. Bisherige Veröffentlichungen haben Methoden der Zwangsernährung und des rülpsenden nervenfreien Hydra beschrieben , wobei jedoch diese Protokolle die Verwendung von Mikropipettenspitzen beinhalten, die von Hand sorgfältig auf die entsprechende Größe gezogen werden müssen, sowie die Verwendung eines Mundstücks, das durch die Rohrleitung 14 mit der Pipette verbunden ist. Hier wird eine einfachere, sicherere und zeitgerekere Methode der Fütterung und des Rülpens beschrieben.
Darüber hinaus untersuchten frühere Studien die Abwesenheit von Nervenzellen durch die Dissoziation von fixierten Tieren in einzelne Zellen und die Untersuchung der Zellmorphologie 3 , 4 , 15 . HDie Immunhistochemie mit einem monoklonalen Antikörper gegen den tyrosinierten Carboxylterminus von alpha-Tubulin wurde als komplementäre Methode zur Mazeration verwendet, um die Erschöpfung von Neuronen im Hypostom 13 , 16 zu überprüfen. Frühere Studien haben gezeigt, dass Neuronen im Stiel auch mit diesem Antikörper 13 sichtbar gemacht werden können, aber diese Neuronen sowie die in der Körpersäule sind schwerer zu erkennen. Während die Immunhistochemie ausreicht, um die Abwesenheit von Nervenzellen im Hypostom zu bestätigen und keine Kompetenz auf die Zelltyp-Morphologie erfordert, kann sie nicht dazu verwendet werden, auf die Abwesenheit der interstitiellen Stammzellen und der anderen Derivate dieser Zellen zu prüfen. Dissoziations- und Zellmorphologie-Studien sind strenger und können eine quantitative Berücksichtigung der Anzahl der einzelnen Zelltypen, die nach jedem Stadium der Behandlung verbleiben, geben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hydra interstitielle Zellen können durch eine Doppel-Colchicin-Behandlung 3 , 4 eliminiert werden. In den Tagen nach der ersten Behandlung ist es entscheidend, den Kontakt zwischen der einzelnen Hydra zu verhindern, um die Verschmelzung von Hydra- Stücken in deformierte Hydra zu vermeiden. Auch Tiere, die nach der ersten Behandlung unbeaufsichtigt essen können, müssen entfernt werden, da die zweite Colchicinbehandlung nich…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Dick Campbell (UC Irvine) für Gespräche über das ursprüngliche Protokoll zur Erstellung und Pflege von nervenfreien Tieren, Frau Rui Wang für Hilfe bei der Anpassung der Spritzen- und Nadeltechnik und Frau Danielle Hagstrom und Dr. Rob Steele (UC Irvine) für Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde von der RCSA und NSF Grant CMMI-1463572 unterstützt.
Materials
| Colchicine | Acros Organics | 227120010 | |
| 1 ml Syringe | BD | 301025 | |
| Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | N/A | Can be purchased locally |
| Brine Shrimp Hatchery Dish | Brine Shrimp Direct | N/A | |
| 60 mm x 15 mm Petri Dish | Celltreat | 229663 | |
| 30 G x 3/4" Hypodermic Needle | Covidien | 1188830340 | A 27G needle may also be used |
| 2 x Fine-tip Tweezers | Dumont | 0109-5-PO | |
| Rifampicin | EMD Millipore | 557303 | |
| Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate) | Enzo | ADI-SAB-100-J | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Scalpel | Fisher | 08-920A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| PBS Tablets | MP Bio | 2810305 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine | Sigma | T9028 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 216763 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Triton X – 100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Air Pump | Tetra | 77846-00 | |
| Glass Pasteur Pipette | VWR | 53283-916 | Length of the pipet does not matter |
| 15 ml Tube | VWR | 89039-670 | |
| P320 Sandpaper | 3M | IBGABBV00397 | Can be purchased at local home improvement store |
Referências
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