Geração e Manutenção a Longo Prazo de Nerve-free<em> Hydra</em
Summary
Através de um tratamento duplo com colchicina, uma toxina derivada de plantas que mata células separadoras, Hydra vulgaris isenta de nervos pode ser gerada. Essas Hydra não podem alimentar ou criar por conta própria. Este artigo descreve um método melhorado para a manutenção a longo prazo de Hydra vulgaris sem nervos no laboratório.
Abstract
A linhagem celular intersticial de Hydra inclui células estaminais multipotentes e seus derivados: células da glândula, nematócitos, células germinativas e células nervosas. As células intersticiais podem ser eliminadas através de dois tratamentos consecutivos com colchicina, uma toxina derivada de plantas que mata células em divisão, eliminando o potencial de renovação das células diferenciadas derivadas das células estaminais intersticiais. Isso permite a geração de Hydra que carece de células nervosas. Um pólipo livre de nervos não pode abrir a boca para alimentar, por exemplo, ou regular a pressão osmótica. Tais animais, no entanto, podem sobreviver e ser cultivados indefinidamente no laboratório, se regularmente forçados e erguidos. A falta de células nervosas permite estudos sobre o papel do sistema nervoso na regulação do comportamento e regeneração dos animais. Os protocolos previamente publicados para a manutenção da Hydra sem nervos envolvem técnicas desatualizadas, como a pipetagem bucal com micropipetas tIps para alimentar e limpar a Hydra . Aqui, é introduzido um protocolo melhorado para a manutenção da hidra livre de nervos. As pinças de ponta fina são usadas para forçar a abertura da boca e inserir Artemia recentemente matada. Após a alimentação forçada, a cavidade do corpo do animal é lavada com meio fresco usando uma seringa e uma agulha hipodérmica para remover material não digerido, aqui referido como "eructo". Este novo método de alimentação forçada e eructação de hidratação livre de nervos através do uso de fórceps e seringas elimina a necessidade de pipetagem bucal usando pontas de micropipetas extraídas à mão. Isso torna o processo mais seguro e significativamente mais eficiente no tempo. Para garantir que as células nervosas no hipossêtomo tenham sido eliminadas, é realizada a imuno-histoquímica utilizando tirosina-tubulina.
Introduction
O sistema nervoso de Hydra consiste em uma rede nervosa, com neurônios associados a ambas as camadas de tecido epitelial 1 . A rede nervosa é mais densa no hipossênero e pedúnculo e menos densa na coluna 2 do corpo. As células nervosas são originárias de células estaminais intersticiais, que são células-tronco multipotentes que originam células secretoras, nematócitos, células germinativas e neurônios 1 . É possível eliminar as células intersticiais de Hydra vulgaris através do tratamento com colchicina 3 , 4 , uma toxina derivada de plantas que mata células em divisão. Embora a colicicina tenha inibido a polimerização de microtúbulos em outros organismos, um estudo anterior mostrou que os microtúbulos estão presentes na Hydra ao longo de todo o tratamento, sugerindo que a colchicina não age dessa maneira na Hydra 3 . Outra stSugere que a colchicina não se liga de forma eficiente à tubulina em alguns organismos, incluindo Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas e Schizosaccharomyces pombe, o que pode explicar essa diferença 5 . O tratamento com colchicina induz a fagocitose das células intersticiais pelas células epiteliais endodérmicas 3 e, portanto, permite a criação de animais que faltam células nervosas, células da glândula e nematócitos. Não está claro por que as células intersticiais são particularmente suscetíveis ao tratamento com colchicina. Dado que as células intersticiais pós-mitóticas e a linhagem das células estaminais intersticiais são danificadas e fagocitadas, Campbell concluiu que a colicicina não afetou diretamente a atividade mitótica 3 . Notavelmente, o tratamento com colchicina funciona bem em Hydra vulgaris, mas foi demonstrado que não funciona também em outras espécies, como Hydra oligactis 6 . </Em> Um tratamento modificado com colchicina e hidroxiureia pode ser usado para produzir Hydra viridis livre de nervos 7 . A hidra sem nervos (também às vezes referida como " Hydra epitelial" 8 ) é, portanto, uma ferramenta útil para estudar os papéis desses tipos de células especializadas a partir da linhagem celular intersticial na homeostase e regeneração do tecido.
Hydra pode ser o único exemplo conhecido de um animal capaz de viver sem um sistema nervoso. Hydra sem nervos serve como um modelo particularmente útil para dissecar o papel da rede nervosa na regulação da regeneração, homeostase e comportamento da Hydra . Por exemplo, a introdução de células intersticiais na hidra livre de nervos através do enxerto permitiu a caracterização da diferenciação de células nervosas como altamente específico da região 9 . Além disso, uma vez que Hydra livre de nervos pode se regenerar, elesPermitir a investigação de caminhos de regeneração independentes do sistema nervoso. Um desses exemplos é a neurogênese apical e a formação da cabeça, que demonstrou depender da função cnox-2 no sistema nervoso em Hydra de tipo selvagem, mas parece ser dispensável na hidra livre de nervos, sugerindo que pode haver um processo alternativo de regeneração da cabeça 10 .
A hidra sem nervos também tem sido utilizada para estudar a expressão das células epiteliais e a regulação de genes neurogênicos e de neurotransmissão após a perda de neurogênese 11 . A hidra sem nervos não exibe rajadas de contração espontâneas 12 , indicando que essas explosões são reguladas pelo sistema nervoso. Hydra do Nerve-free, no entanto, contrata em resposta a beliscar a coluna do corpo com fórceps, sugerindo que a contração em resposta a estímulos mecânicos é mediada por acoplamento através deJunções gap gh nas células epiteliais, enquanto o comportamento contrátil espontâneo é mediado pelo acoplamento através de junções gap nas células nervosas 13 .
A hidra sem nervos não abre a boca quando é apresentada com alimentos ou glutationa reduzida 3 , sugerindo que os neurônios sensoriais são necessários para detectar a presença de alimentos e sinalizar a boca para abrir. Além disso, a rede nervosa parece desempenhar um papel na detecção da pressão osmótica, porque os animais sem nervos são incapazes de regular de forma autônoma sua pressão hidrostática interna através da abertura da boca, causando a aparência característica do balão 3 , 4 ( Figura 1B ). O regulamento da pressão hidrostática na hidra livre de nervos por deflação manual freqüente levou à perda de alguma morfologia anormal na coluna de hipossetro e corpo. No entanto, a deflação crônica levou à interferência com o crescimento,Organização de articulação, brotação e tecido 8 .
Embora a hidra não livre de nervos seja incapaz de alimentar e, por exemplo, sozinha, é possível mantê-los indefinidamente no laboratório manualmente forçando e erguendo cada animal. Publicações anteriores descreveram métodos de alimentação forçada e eructação de Hydra sem nervos, no entanto, esses protocolos envolveram o uso de dicas de micropipetas que devem ser puxadas manualmente para o tamanho apropriado, bem como o uso de um bocal conectado à pipeta pela tubulação 14 . Aqui, é descrito um método de alimentação e burping mais simples, seguro e com maior tempo.
Além disso, estudos anteriores envolveram verificar a ausência de células nervosas através da dissociação de animais fixos em células individuais e exame de morfologia celular 3 , 4 , 15 . HAntes, foi utilizada a imuno-histoquímica com um anticorpo monoclonal contra o terminal carboxilo tirosinado da alfa-tubulina como método complementar para maceração para verificar a depleção de neurônios no hiposstoma 13,16. Estudos anteriores mostraram que os neurônios no pedúnculo também podem ser visualizados usando este anticorpo 13 , no entanto, esses neurônios, bem como aqueles na coluna do corpo, são mais difíceis de distinguir. Embora a imuno-histoquímica seja suficiente para confirmar a ausência de células nervosas no hiposstoma e não requer experiência em morfologia do tipo celular, não pode ser usado para verificar a ausência das células estaminais intersticiais e os outros derivados dessas células. Os estudos de dissociação e morfologia celular são mais rigorosos e podem fornecer uma contagem quantitativa dos números de cada tipo de célula que permanece após cada etapa do tratamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
As células intersticiais da Hydra podem ser eliminadas através de um tratamento com colchicina dupla 3 , 4 . Nos dias que se seguem ao primeiro tratamento, é fundamental evitar o contato entre Hydra individual para evitar a fusão de peças Hydra em Hydra deformada. Além disso, os animais que podem comer sem assistência após o primeiro tratamento devem ser removidos, pois o segundo tratamento com colchicina pode…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem ao Dr. Dick Campbell (UC Irvine) por discussões sobre o protocolo original para gerar e manter animais sem nervos, a Sra. Rui Wang para ajudar a adaptar a seringa e a técnica da agulha, e a Sra. Danielle Hagstrom e o Dr. Rob Steele (UC Irvine) para comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela concessão RCSA e NSF CMMI-1463572.
Materials
| Colchicine | Acros Organics | 227120010 | |
| 1 ml Syringe | BD | 301025 | |
| Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | N/A | Can be purchased locally |
| Brine Shrimp Hatchery Dish | Brine Shrimp Direct | N/A | |
| 60 mm x 15 mm Petri Dish | Celltreat | 229663 | |
| 30 G x 3/4" Hypodermic Needle | Covidien | 1188830340 | A 27G needle may also be used |
| 2 x Fine-tip Tweezers | Dumont | 0109-5-PO | |
| Rifampicin | EMD Millipore | 557303 | |
| Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate) | Enzo | ADI-SAB-100-J | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Scalpel | Fisher | 08-920A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| PBS Tablets | MP Bio | 2810305 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine | Sigma | T9028 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 216763 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Triton X – 100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Air Pump | Tetra | 77846-00 | |
| Glass Pasteur Pipette | VWR | 53283-916 | Length of the pipet does not matter |
| 15 ml Tube | VWR | 89039-670 | |
| P320 Sandpaper | 3M | IBGABBV00397 | Can be purchased at local home improvement store |
Referências
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