Generazione e manutenzione a lungo termine di nervi liberi<em> Hydra</em
Summary
Attraverso un doppio trattamento con colchicina, può essere generata una tossina derivata da piante che uccide cellule divisorie, senza idrografia Hydra vulgaris . Questi Hydra non possono nutrire o esaminare da soli. Questo documento descrive un metodo migliorato per la manutenzione a lungo termine di Idra vulgaris privo di nervi in laboratorio.
Abstract
La linea di cellule interstiziali di Hydra comprende cellule staminali multipotenti ei loro derivati: cellule ghiandolari, nematociti, cellule germinali e cellule nervose. Le cellule interstiziali possono essere eliminate mediante due trattamenti consecutivi con colchicina, una tossina derivata da piante che uccide le cellule divisorie, eliminando così il potenziale di rinnovamento delle cellule differenziate derivate dalle cellule staminali interstiziali. Ciò consente alla generazione di Hydra che mancano di cellule nervose. Un polipo privo di nervi non può aprire la bocca per alimentare, controllare o regolare la pressione osmotica. Tali animali, tuttavia, possono sopravvivere e essere coltivati indefinitamente in laboratorio se regolarmente alimentati e burped. La mancanza di cellule nervose consente di studiare il ruolo del sistema nervoso nel regolare il comportamento e la rigenerazione degli animali. I protocolli precedentemente pubblicati per la manutenzione Idra libera da idrocarburi comprendono tecniche obsolete quali la pipettazione a bocca con micropipetta tirata a manoIps per alimentare e pulire l' Hydra . Qui viene introdotto un miglioramento del protocollo per la manutenzione di Idra priva di nervi. Le pinze fine-punte vengono utilizzate per forzare la bocca e inserire Artemia appena uccisa. Dopo l'alimentazione della forza, la cavità del corpo dell'animale viene lavata con un mezzo fresco usando una siringa e un ago ipodermico per rimuovere il materiale non digerito, qui indicato come "burping". Questo nuovo metodo di erogazione di forza e burping Hydra senza nervi attraverso l'uso di pinze e siringhe elimina la necessità di pipettazione a bocca con punte a micropipetta tirate a mano. Questo rende il processo più sicuro e significativamente più tempo efficiente. Per garantire che le cellule nervose nel iostomo siano state eliminate, viene condotta l'immunohistochemistry usando l'anti-tirosina-tubulina.
Introduction
Il sistema nervoso di Hydra è costituito da una rete nervosa, con i neuroni associati a entrambi gli strati di tessuto epiteliale 1 . La rete nervosa è più densa nel hypostome e nel peduncolo e meno densa nella colonna del corpo 2 . Le cellule nervose provengono da cellule staminali interstiziali, che sono cellule staminali multipotenti che danno origine a cellule secretarie, nematociti, cellule germinali e neuroni 1 . È possibile eliminare le cellule interstiziali di Hydra vulgaris attraverso il trattamento con colchicina 3 , 4 , una tossina derivata da piante che uccide cellule divisorie. Anche se la colchicina è stata trovata per inibire la polimerizzazione del microtubulo in altri organismi, uno studio precedente ha dimostrato che i microtubuli sono presenti in Hydra per tutto il trattamento, suggerendo che la colchicina non agisce in Hydra 3 . Un altro stUdy suggerisce che la colchicina non lega efficacemente la tubulina in alcuni organismi, tra cui Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas e Schizosaccharomyces pombe, che possono spiegare questa differenza 5 . Il trattamento della colchicina induce la fagocitosi delle cellule interstiziali dalle cellule epiteliali endodermiche 3 e consente quindi la creazione di animali che mancano di cellule nervose, di cellule ghiandolari e nematociti. Non è chiaro perché le cellule interstiziali siano particolarmente sensibili al trattamento della colchicina. Dato che entrambe le cellule interstitiali post-mitotiche e le cellule delle cellule staminali interstiziali sono danneggiate e fagocitose, Campbell ha concluso che la colchicina non influiva direttamente l'attività mitotica 3 . In particolare, il trattamento colchicina funziona bene in Hydra vulgaris, ma è stato dimostrato di non funzionare anche in altre specie, come Hydra oligactis 6 . </Em> Un trattamento modificato con colchicina e idrossiacido può essere utilizzato per produrre Idra viridis 7 privo di nervi. Idra priva di nervi (anche a volte definita come " Hydra epiteliale" 8 ) sono quindi uno strumento utile per studiare i ruoli di questi tipi di cellule specializzate dalla linea di cellule interstitiali nell'omeostasi tissutale e nella rigenerazione.
L'idra può essere l'unico esempio noto di un animale capace di vivere senza un sistema nervoso. Idra priva di nervi servono come un modello particolarmente utile per dissectare il ruolo della rete nervosa nella regolazione della rigenerazione idraulica , dell'omeostasi e del comportamento. Ad esempio, l'introduzione di cellule interstiziali in Idra priva di nervi tramite innesto ha permesso di caratterizzare la differenziazione delle cellule nervose come regione altamente specifica 9 . Inoltre, perché l' Idra priva di nervi può rigenerarsiConsentire l'indagine di percorsi alternativi di rigenerazione indipendenti dal sistema nervoso. Un esempio di questo tipo è la neurogenesi apicale e la formazione delle teste, che è stato dimostrato dipendente dalla funzione cnox-2 nel sistema nervoso di tipo idrico tipico , ma sembra essere dispensabile in Idra priva di nervi, suggerendo che ci possa essere un processo alternativo di rigenerazione della testa 10 .
Hydra senza nervi sono stati utilizzati anche per studiare l'espressione delle cellule epiteliali e la regolazione dei geni neurogenici e neurotrasmettitori dopo la perdita della neurogenesi 11 . L' Idra priva di nervi non presenta esplosioni spontanee di contrazione 12 , indicando che queste esplosioni sono regolate dal sistema nervoso. L' Idra priva di nervi, invece, si contrae in risposta al pizzicamento della colonna corporea, suggerendo che la contrazione in risposta agli stimoli meccanici è mediata dall'accoppiamentoGh junction in cellule epiteliali, mentre il comportamento contrattile spontaneo è mediato da accoppiamento attraverso giunzioni gap nelle cellule nervose 13 .
Idra priva di nervi non apre le bocche quando viene presentata con cibo o ridotto glutatione 3 , suggerendo che neuroni sensoriali sono necessari per rilevare la presenza di cibo e segnalare la bocca da aprire. Inoltre, la rete nervosa sembra svolgere un ruolo nel rilevare la pressione osmotica, poiché gli animali privi di nervi non sono in grado di regolare autonomamente la loro pressione idrostatica interna attraverso l'apertura della bocca, causando il loro aspetto simile al pallone 3 , 4 ( figura 1B ). La regolazione della pressione idrostatica in Hydra priva di nervi con una frequente deflazione manuale ha portato ad una perdita di qualche morfologia anormale nella colonna del hypostome e del corpo. Tuttavia, la deflazione cronica ha causato interferenze con la crescita, elOngation, germinazione e organizzazione dei tessuti 8 .
Sebbene l' idra priva di nervi non sia in grado di nutrirsi e di esplorare da soli, è possibile mantenerli a tempo indefinito in laboratorio mediante l'alimentazione manuale a mano e burping ogni animale. Le pubblicazioni precedenti hanno descritto metodi di forza-alimentazione e burping Hydra senza nervi, tuttavia questi protocolli hanno coinvolto l'uso di punte di micropipette che devono essere manualmente tirato con attenzione alla dimensione appropriata, nonché l'uso di un boccaglio collegato alla pipetta da tubo 14 . Qui viene descritto un metodo più semplice, più sicuro e più efficiente nel tempo per l'alimentazione e il burping.
Inoltre, studi precedenti hanno coinvolto il controllo dell'assenza di cellule nervose attraverso la dissociazione degli animali fissi in singole cellule e l'esame della morfologia cellulare 3 , 4 , 15 . HL'immunohistochemistry con un anticorpo monoclonale contro il terminale carbossilato tirosinato di alfa-tubulina è stato usato come metodo complementare alla macerazione per verificare l'esaurimento dei neuroni nell'ipostomo 13 , 16 . Studi precedenti hanno dimostrato che i neuroni nel peduncolo possono anche essere visualizzati utilizzando questo anticorpo 13 , tuttavia questi neuroni e quelli della colonna corporea sono più difficili da definire. Mentre l'immunohistochemistry è sufficiente a confermare l'assenza di cellule nervose nel hypostome e non richiede competenze sulla morfologia di tipo cellulare, non può essere utilizzato per verificare l'assenza delle cellule staminali interstitiali e degli altri derivati di queste cellule. Gli studi sulla dissociazione e sulla morfologia cellulare sono più rigorosi e possono dare un resoconto quantitativo dei numeri di ciascun tipo di cellula che rimangono dopo ogni fase del trattamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le cellule interstiziali Idra possono essere eliminate tramite un doppio trattamento con colchicina 3 , 4 . Nei giorni successivi al primo trattamento, è fondamentale impedire il contatto tra l' idra individuale per evitare la fusione di pezzi Hydra de idra deformata. Inoltre, gli animali che possono mangiare non assistiti dopo il primo trattamento devono essere rimossi in quanto il secondo trattamento della colc…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il dottor Dick Campbell (UC Irvine) per discutere del protocollo originale per la generazione e il mantenimento di animali privi di nervi, la sig.ra Rui Wang per aiutare ad adattare la siringa e la tecnica dell'ago, e la signora Danielle Hagstrom e il dottor Rob Steele (UC Irvine) per i commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da RCSA e NSF concedere CMMI-1463572.
Materials
| Colchicine | Acros Organics | 227120010 | |
| 1 ml Syringe | BD | 301025 | |
| Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | N/A | Can be purchased locally |
| Brine Shrimp Hatchery Dish | Brine Shrimp Direct | N/A | |
| 60 mm x 15 mm Petri Dish | Celltreat | 229663 | |
| 30 G x 3/4" Hypodermic Needle | Covidien | 1188830340 | A 27G needle may also be used |
| 2 x Fine-tip Tweezers | Dumont | 0109-5-PO | |
| Rifampicin | EMD Millipore | 557303 | |
| Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate) | Enzo | ADI-SAB-100-J | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Scalpel | Fisher | 08-920A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| PBS Tablets | MP Bio | 2810305 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine | Sigma | T9028 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 216763 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Triton X – 100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Air Pump | Tetra | 77846-00 | |
| Glass Pasteur Pipette | VWR | 53283-916 | Length of the pipet does not matter |
| 15 ml Tube | VWR | 89039-670 | |
| P320 Sandpaper | 3M | IBGABBV00397 | Can be purchased at local home improvement store |
Referências
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