Cryopreservation Zebrafish Spermatogonia के पूरे testes सुई द्वारा अल्ट्रा तेजी से ठंडा डूबे
Summary
इस अध्ययन का मुख्य उद्देश्य सुई डूबकर vitrification (एनआईवी) प्रक्रिया को cryopreserve पूरे zebrafish tests को ढालने का था. इसके अतिरिक्त, पांच अलग zebrafish उपभेदों में विधि की पुनरावृत्ति का परीक्षण किया गया ।
Abstract
विज्ञान और जैव प्रौद्योगिकी के वर्तमान रुझानों मॉडल जीवों में नई लाइनों के हजारों के निर्माण के लिए सीसा जिससे प्रजनन कालोनियों रखने के आम प्रथाओं से परे आनुवंशिक संसाधनों के सुरक्षित भंडारण के लिए नए तरीकों के लिए आवश्यकता के लिए अग्रणी । इस अध्ययन का मुख्य उद्देश्य सुई डूबकर vitrification (एनआईवी) प्रक्रिया को cryopreserve पूरे zebrafish tests को ढालने का था. Cryopreservation पूरे testes एनआईवी द्वारा प्रारंभिक चरण रोगाणु कोशिकाओं के zebrafish आनुवंशिक संसाधनों के भंडारण के लिए संभावनाएं प्रदान करता है, विशेष रूप से प्रत्यारोपण के बाद से वे दोनों पुरुष और महिला gametes में परिपक्व कर सकते हैं । testes, एक एक्यूपंक्चर सुई पर टिकी थी, दो cryoprotective मीडिया में equilibrated (equilibration समाधान युक्त १.५ एम मेथनॉल और १.५ एम propylene ग्लाइकोल; और vitrification समाधान युक्त 3 एम dimethyl sulfoxide और 3 एम propylene ग्लाइकोल) और तरल नाइट्रोजन में डूब गया । नमूने तीन फलस्वरूप वार्मिंग समाधान की एक श्रृंखला में गर्म थे । इस तकनीक का मुख्य लाभ कर रहे है (1) गर्म परीक्षण के पाचन के बाद शुक्राणु की कमी इस प्रकार बहाव जोड़तोड़ की सुविधा; (2) अल्ट्रा तेजी से ठंडा ऊतकों के इष्टतम जोखिम को सक्षम करने तरल नाइट्रोजन इसलिए अधिकतम ठंडा और cryoprotectants की आवश्यकता एकाग्रता को कम करने, जिससे उनके विषाक्तता को कम करने; (3) cryoprotectants और तरल नाइट्रोजन के लिए कई परीक्षण के तुल्यकालिक एक्सपोजर; और (4) पांच अलग zebrafish उपभेदों में ५०% से ऊपर की व्यवहार्यता प्राप्त करने के द्वारा प्रदर्शन दोहराया ।
Introduction
उपंयास विज्ञान और जैव प्रौद्योगिकी के रुझान में चूहों के नए उत्परिवर्ती लाइनों के हजारों के निर्माण के लिए नेतृत्व किया है, Drosophila, zebrafish और अंय जैव चिकित्सा और अंय विज्ञान में मॉडल जीवों के रूप में इस्तेमाल किया प्रजातियों1। इसके अलावा, नई प्रौद्योगिकियों के रूप में विकसित कर रहे है और उपलब्ध हो, उत्परिवर्ती लाइनों की संख्या में तेजी से2वृद्धि हुई है । इससे प्रजनन कॉलोनियों को रखने की आम पद्धतियों से परे आनुवांशिक संसाधनों के सुरक्षित भंडारण की आवश्यकता होती है. एक विधि है जो समय की एक अनिश्चित अवधि के लिए आनुवंशिक संसाधनों के सुरक्षित भंडारण में सक्षम बनाता है के रूप में, cryopreservation प्रजनन के मौसम के विस्तार के रूप में कई फायदे प्रदान करता है, ब्रुडस् टॉक का के सतत रखरखाव के लिए की जरूरत को दरकिनार, और यह अधिक लागत है और श्रम-कुशल2.
पिछले कई वर्षों के दौरान विकसित शुक्राणु cryopreservation के लिए प्रोटोकॉल2,3,4 zebrafish पुरुष आनुवंशिक सामग्री के सफल भंडारण के लिए अवसर प्रदान करते हैं । हालांकि, अंडे या मछलियों में भ्रूण की cryopreservation उनकी जटिल संरचना और बड़ी मात्रा में जर्दी सामग्री के कारण अभी तक संभव नहीं है । हाल ही में, मौलिक रोगाणु कोशिकाओं (PGCs) या spermatogonial स्टेम सेल (एसएससी) के प्रत्यारोपण के अभ्यास कार्यात्मक शुक्राणु और प्रत्यारोपण के बाद अंडे में विकसित करके इस बाधा को बाईपास5प्रदान करता है । इसलिए, एसएससी के cryopreservation दुर्लभ और मूल्यवान आनुवंशिक संसाधनों के संरक्षण में एक नई सीमा प्रदान करता है ।
हालांकि cryopreservation कई फायदे प्रदान करता है, धीमी गति से दर ठंड प्रक्रिया कई स्थितियों है कि कोशिका क्षति के लिए नेतृत्व कर सकते है उत्पंन करता है2। इनमें intracellular और extracellular बर्फ गठन, निर्जलीकरण, cryoprotectant विषाक्तता और अन्य शामिल हैं । Intracellular बर्फ नुकसान कोशिकाओं, extracellular बर्फ कोशिकाओं के यांत्रिक कुचलने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, जबकि धीमी दर ठंड के दौरान कोशिकाओं से पानी प्रसार निर्जलीकरण6के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. हाल ही में, एक तकनीक है जो बर्फ गठन के नकारात्मक प्रभाव को रोकता है के रूप में vitrification मछली gametes7,8,9के cryopreservation में लागू किया गया है । यह एक अल्ट्रा तेजी से ठंडा तकनीक प्रस्तुत करता है जिसके माध्यम से आंतरिक और बाहरी मीडिया बर्फ7,10में crystalizing बिना एक अमली/ वृषण और डिंबग्रंथि के ऊतकों के सफल vitrification एवियन और स्तनधारी प्रजातियों में सबूत दिया गया है10,11,12, इस प्रकार मछली में अपने आवेदन के लिए संभावनाओं को खोलने, के रूप में अच्छी तरह से ।
इस अध्ययन में, हम पूरे zebrafish testes के cryopreservation के लिए सुई डूबे vitrification (एनआईवी) प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं । हम संदूषण के बिना zebrafish प्रारंभिक चरण रोगाणु कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक विश्वसनीय तरीका है और एक cryopreservation प्रक्रिया है कि अंय कोशिकाओं, विशेष रूप से शुक्राणु की एक कम उपस्थिति के साथ प्रारंभिक चरण रोगाणु कोशिकाओं के अपेक्षाकृत उच्च मात्रा में पैदावार का प्रदर्शन । हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, यह पहली अध्ययन है अल्ट्रा के लिए एक विस्तृत visualized प्रोटोकॉल प्रदर्शित करने के लिए मछली जननांगों ऊतक और zebrafish germline कोशिकाओं के तेजी से ठंडा । इसके अतिरिक्त, विधि की पुनरावृत्ति पांच अलग zebrafish उपभेदों में प्रदर्शन किया है: अब जंगली प्रकार, कैस्पर (रॉय-/ nacre-/-), तेंदुआ (लियोt1/t1), वासा [टीजी (वॉज:: eGFP)] और Wilms ट्यूमर [टीजी (wt1b:: eGFP 1)] ट्रांसजेनिक लाइन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन का मुख्य उद्देश्य था सुई में डूबे अल्ट्रा तेजी से शीतलन एवियन और स्तनधारी प्रजातियों के लिए विकसित की प्रक्रिया10,11,12 मछली वृषण के cryopreservation के लिए (एक मॉडल के रू?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह अध्ययन राष्ट्रीय अनुसंधान, विकास और नवाचार हंगरी के कार्यालय (अनुदान ११६९१२ करने के लिए ÁH), लागत कार्यालय (खाद्य और कृषि लागत कार्ययोजना FA1205: AQUAGAMETE), Stipendium Hungaricum छात्रवृत्ति कार्यक्रम (अनुदान के लिए ZM) और नए द्वारा समर्थित किया गया था हंगेरियन राष्ट्रीय उत्कृष्टता डॉक्टरेट फैलोशिप (EK करने के लिए अनुदान).
Materials
| Leibovitz media (L-15) | Sigma-Aldrich | L1518 | Supplemented with L-glutamine |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Trehalose | Acros Organics | 99-20-7 | Dihydrate |
| Methanol | Reanal | 20740-0-08-65 | |
| Propylene glycol | Reanal | 08860-1-08-65 | |
| Dimethyl sulfoxide | Reanal | 00190-1-01-65 | |
| Collagenase | Gibco | 9001-12-1 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8003 | |
| DNase I | Panreac AppliChem | A3778 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | Tablets for preparation of 200 ml PBS solution |
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