Kryonisk bevaring av sebrafisk Spermatogonia av hele testiklene p midt ultra rask nedkjøling
Summary
Hovedformålet med denne studien var å tilpasse nålen midt vitrifikasjon (NIV) prosedyre for å cryopreserve hele sebrafisk testiklene. I tillegg ble repeatability av metoden i fem forskjellige sebrafisk stammer testet.
Abstract
Dagens trender i vitenskap og bioteknologi føre til etablering av nye linjer i modellen organismer og dermed fører til nødvendigheten av nye metoder for sikker lagring av genetiske ressurser utenfor den felles praksisen av avl kolonier. Hovedformålet med denne studien var å tilpasse nålen midt vitrifikasjon (NIV) prosedyre for å cryopreserve hele sebrafisk testiklene. Kryonisk bevaring av tidlig stadium bakterie celler av hele testiklene NIV tilbyr muligheter for lagring av sebrafisk genetiske ressurser, spesielt siden etter transplantasjon kan de eldre til både mannlige og kvinnelige gameter. Prøvene ble fjernet, festet på en akupunktur p, equilibrated i to cryoprotective media (balanse løsning som inneholder 1,5 M metanol og 1,5 M propylenglykol; og vitrifikasjon inneholder 3 M dimethyl sulfoxide og 3 M propylenglykol) og styrtet ut i flytende nitrogen. Prøvene ble varmet i en serie av tre påfølgende oppvarming løsninger. De viktigste fordelene med denne teknikken er (1) mangel på spermatozoa etter fordøyelsen av varmet testiklene dermed tilrettelegge nedstrøms manipulasjoner; (2) Ultra rask nedkjøling muliggjør optimale eksponering for vev flytende nitrogen derfor maksimere kjøling og redusere nødvendige konsentrasjonen av cryoprotectants, og dermed redusere giftigheten; (3) synkron eksponering for flere testiklene cryoprotectants og flytende nitrogen; og (4) repeterbarhet demonstrert ved å skaffe levedyktigheten til over 50% i fem forskjellige sebrafisk stammer.
Introduction
Romanen trender i vitenskap og bioteknologi har ført til etableringen av nye mutant linjer av mus, Drosophila, sebrafisk og andre arter som modell organismer i biomedisinsk og andre vitenskaper1. Videre som nye teknologier er utviklet og blir tilgjengelig, øke antall mutant linjer stadig2. Dette fører til nødvendigheten for en sikker lagring av genetiske ressurser utenfor den felles praksisen av avl kolonier. Som en metode som gir trygg lagring av genetiske ressurser på ubestemt tid, kryonisk bevaring tilbyr mange fordeler som forlengelse av reproduktive sesongen, omgår behovet for kontinuerlig vedlikehold av fiskestammer, og det er flere kostnader – og arbeidskrevende effektiv2.
Protokoller for sperm kryonisk bevaring utviklet under siste flere år2,3,4 tilbyr muligheten for vellykket lagring av sebrafisk mannlige genetisk materiale. Imidlertid er kryonisk bevaring av egg eller embryo i fisk ennå ikke mulig på grunn av deres kompleks struktur og store mengder eggeplomme materiale. Nylig, praktisering av transplantasjon av primordial bakterie celler (PGCs) eller spermatogonial stamceller (SSCs) tilbyr en bypass å denne barrieren ved å utvikle i funksjonelle sæd og egg etter transplantasjon5. Derfor tilbyr kryonisk bevaring av SSCs en ny grense i bevaring av sjeldne og verdifulle genetiske ressurser.
Selv om kryonisk bevaring gir mange fordeler, genererer langsom hastighet frysing prosessen flere forhold som kan føre til celle skade2. Disse inkluderer intracellulær og ekstracellulære isdannelse, dehydrering, kryoprotektant giftighet og andre. Intracellulær is skader cellene, ekstracellulære isen kan føre til mekanisk knusing av celler, mens vann diffusjon fra cellene under sakte-rate frysing kan føre til dehydrering6. Nylig vitrifikasjon som en teknikk som hindrer de negative effektene av isdannelse har vært brukt i kryonisk bevaring av fisk gameter7,8,9. Den presenterer en svært rask nedkjøling teknikk som interne og eksterne media blir en amorf/glassaktig tilstand uten crystalizing i isen7,10. Vellykket vitrifikasjon av testicular og eggstokkreft vev har vært dokumentert i avian og pattedyr10,11,12, dermed åpne muligheter for sin søknad i fisk, også.
I denne studien presenterer vi p midt vitrifikasjon (NIV) fremgangsmåten for kryonisk bevaring av hele sebrafisk testiklene. Vi viser en pålitelig metode for isolering av sebrafisk tidlig stadium bakterie celler uten forurensning og en kryonisk bevaring prosess som gir relativt store mengder tidlig stadium bakterie celler med en lav forekomst av andre celler, spesielt spermatozoa. Best av vår kunnskap er dette den første studien å demonstrere en detaljert visualisert protokoll for ultra rask nedkjøling av fisk gonadal vev og sebrafisk germline celler. I tillegg repeterbarhet metoden demonstreres i fem forskjellige sebrafisk stammer: AB wild type, casper (roy– / –; nacre– / –), leopard (leot1/t1), vasa [vs (vas::eGFP)] og Wilms svulst [vs (wt1b::eGFP 1)] transgene linje.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hovedformålet med denne studien var å tilpasse nålen midt ultra rask nedkjøling prosedyre utviklet for fugleinfluensa og pattedyr10,11,12 til kryonisk bevaring av fisk testikkel (sebrafisk som modell organisme). De fleste av de tidligere studiene om kryonisk bevaring sebrafisk genetiske ressurser var hovedsakelig fokusert på kryonisk bevaring av sebrafisk sperm2,3<s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av National forskning, utvikling og innovasjon Office Ungarn (grant 116912 til ÁH) kostnader kontoret (mat og landbruk pris handling FA1205: AQUAGAMETE), Stipendium Hungaricum stipend programmet (grant til ZM) og nye Ungarske nasjonale Excellence Predoctoral fellesskap (grant til EK).
Materials
| Leibovitz media (L-15) | Sigma-Aldrich | L1518 | Supplemented with L-glutamine |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Trehalose | Acros Organics | 99-20-7 | Dihydrate |
| Methanol | Reanal | 20740-0-08-65 | |
| Propylene glycol | Reanal | 08860-1-08-65 | |
| Dimethyl sulfoxide | Reanal | 00190-1-01-65 | |
| Collagenase | Gibco | 9001-12-1 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8003 | |
| DNase I | Panreac AppliChem | A3778 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | Tablets for preparation of 200 ml PBS solution |
Referências
- Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions. Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).
- Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center. Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).
- Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. R. Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio. Theriogenology. 68 (2), 128-136 (2007).
- Morris, J. P., Berghmans, S., Zahrieh, D., Neuberg, D. S., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish sperm cryopreservation with N,N-dimethylacetamide. Biotechniques. 35 (5), 956-968 (2003).
- Yoshizaki, G., et al. Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources. Comp. Biochem. Physiol. Part D: Genomics Proteomics. 6 (1), 55-61 (2011).
- Gao, D., Critser, J. K. Mechanisms of cryoinjury in living cells. ILAR J. 41 (4), 187-196 (2000).
- Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, &. #. 1. 9. 3. ;. Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review. Gen. Comp. Endocrinol. 245, 69-76 (2017).
- Kása, E., et al. Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla). Gen. Comp. Endocrinol. 245, 102-107 (2017).
- Cuevas-Uribe, R., Leibo, S. P., Daly, J., Tiersch, T. R. Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non-equilibrium cooling. Cryobiology. 63 (3), 186-197 (2011).
- Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation. Hum. Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2008).
- Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. Production of Live Offspring from Testicular Tissue Cryopreserved by Vitrification Procedures in Japanese Quail (Coturnix japonica). Biol. Reprod. 88 (5), 124 (2013).
- Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica). Anim. Reprod. Sci. 134 (3-4), 197-202 (2012).
- Lee, S., Yoshizaki, G. Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok). Cryobiology. 72 (2), 165-168 (2016).
- Marques, L. S., et al. Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container. Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).
- Lujić, J., et al. First successful vitrification of salmonid ovarian tissue. Cryobiology. 76, 154-157 (2017).
- Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., García-Ximénez, F. Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods. CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).
- Marinović, Z., et al. Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing. Gen. Comp. Endocrinol. 245, 77-83 (2017).
- Pšenička, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B. Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells. Cryobiology. 72, 119-122 (2016).
- Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).
