Criopreservación de espermatogonios de pez cebra por todo los testículos aguja inmerso enfriamiento ultra rápido
Summary
El objetivo principal de este estudio fue adaptar la aguja inmerso en procedimiento de vitrificación (NIV) para criopreservar los testículos todo pez cebra. Además, se evaluó la repetibilidad del método en cinco cepas diferentes de pez cebra.
Abstract
Tendencias actuales en ciencia y biotecnología conducen a la creación de miles de nuevas líneas en organismos modelo lo lleva a la necesidad de nuevos métodos para el almacenamiento seguro de los recursos genéticos más allá de las prácticas comunes de mantener colonias de cría. El objetivo principal de este estudio fue adaptar la aguja inmerso en procedimiento de vitrificación (NIV) para criopreservar los testículos todo pez cebra. Criopreservación de células de germen incipiente por los testículos todo NIV ofrece posibilidades para el almacenamiento de pez cebra recursos genéticos, especialmente puesto que después maduran a gametos masculinos y femeninos. Los testículos fueron suprimidos, en una aguja de acupuntura, equilibrada en dos medios crioprotectores (solución de equilibrado que contiene 1,5 M metanol y glicol de propileno de 1.5 M; y solución de vitrificación que contiene dimetilsulfóxido de 3 M y 3 M propilenglicol) y sumergida en nitrógeno líquido. Las muestras fueron calentadas en una serie de tres soluciones de calentamiento consiguientes. Las principales ventajas de esta técnica son (1) la falta de espermatozoides después de la digestión de los testículos caliente facilitando manipulaciones posteriores; (2) ultra rápido de enfriamiento que permite la óptima exposición de los tejidos a nitrógeno líquido, por lo tanto maximizar la refrigeración y reducir la necesaria concentración de crioprotectores, reduciendo así su toxicidad; (3) exposición sincrónica de varios testículos crioprotectores y nitrógeno líquido; y repetibilidad (4) demostró mediante la obtención de la viabilidad de sobre el 50% en cinco cepas diferentes de pez cebra.
Introduction
Nuevas tendencias en la ciencia y la biotecnología han llevado a la creación de miles de nuevas líneas mutantes de Drosophila, pez cebra, ratones y otras especies usadas como organismos modelo en biomedicina y otras ciencias1. Además, como nuevas tecnologías se desarrollan y se convierten en disponibles, los números de líneas mutantes aumentan constantemente2. Esto conduce a la necesidad de un almacenamiento seguro de los recursos genéticos más allá de las prácticas comunes de mantener colonias de cría. Como un método que permite el almacenamiento seguro de los recursos genéticos por un período indefinido de tiempo, criopreservación ofrece muchas ventajas tales como extensión de la temporada reproductiva, evita la necesidad de un mantenimiento continuo de los reproductores, y es más costo – y mano de obra eficiente2.
Protocolos de criopreservación de esperma desarrollado durante los últimos varios años2,3,4 ofrecen la oportunidad para el almacenaje acertado del material genético masculino de pez cebra. Sin embargo, la criopreservación de óvulos o embriones de peces todavía no es posible debido a su compleja estructura y grandes cantidades de material de la yema de huevo. Recientemente, la práctica del trasplante de células de germen primordiales (PGCs) o las células madre espermatogonias (SSCs) ofrece un puente a esta barrera mediante el desarrollo funcional de la esperma y huevos después de trasplante5. Por lo tanto, la criopreservación de SSCs ofrece una nueva frontera en la conservación de los recursos genéticos raros y valiosos.
A pesar de que la criopreservación ofrece muchas ventajas, el proceso de congelación lenta tasa genera varias condiciones que pueden llevar a daño de la célula2. Estos incluyen la formación de hielo intracelular y extracelular, deshidratación y toxicidad del crioprotector. Hielo daña las células, hielo extracelular puede conducir a trituración mecánica de las células, mientras que la difusión de agua desde las células durante la tasa lenta de congelación puede conducir a deshidratación6. Recientemente, se ha aplicado vitrificación como una técnica que evita los efectos negativos de la formación de hielo en la criopreservación de gametos de peces7,8,9. Presenta una técnica de enfriamiento ultra rápida a través del cual los medios de comunicación internos y externos se convierten en un estado amorfo/vidrioso sin crystalizing en hielo7,10. Éxito vitrificación de tejido ovárico y testicular ha sido evidenciado en especies de aves y mamíferos10,11,12, abriendo posibilidades para su aplicación en los peces, así.
En este estudio, presentamos el procedimiento de vitrificación (NIV) aguja sumergido para la criopreservación de los testículos todo pez cebra. Demostrar un método confiable para el aislamiento de las células de germen incipiente pez cebra sin contaminación y un proceso de criopreservación que produce cantidades relativamente altas de células de germen incipiente con una baja presencia de otras células, especialmente de espermatozoides. A lo mejor de nuestro conocimiento, éste es el primer estudio en demostrar un protocolo detallado visualizado para el enfriamiento ultra rápido de tejido gonadal de peces y pez cebra del germline células. Además, la repetibilidad del método se demuestra en cinco cepas diferentes de pez cebra: AB tipo salvaje, casper (roy– / –; nácar– / –), leopardo (leot1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] y línea transgénica de Wilms tumor [Tg (wt1b::eGFP 1)].
Protocol
Representative Results
Discussion
El objetivo principal de este estudio fue adaptar la aguja inmerso en procedimiento de enfriamiento ultra rápido desarrollado para especies de aves y mamíferos10,11,12 a la crioconservación de testículo de pez (pez cebra como modelo organismo). La mayoría de los estudios anteriores con respecto a la criopreservación de los recursos genéticos del pez cebra se centraron principalmente en criopreservación de esperma de pez …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por la investigación, desarrollo e innovación oficina de Hungría (grant 116912 a ÁH), la oficina de costos (alimentación y agricultura costo acción FA1205: AQUAGAMETE), el programa de becas beca Hungaricum (ayuda a ZM) y el nuevo Húngaro nacional excelencia Beca Predoctoral (grant EK).
Materials
| Leibovitz media (L-15) | Sigma-Aldrich | L1518 | Supplemented with L-glutamine |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Trehalose | Acros Organics | 99-20-7 | Dihydrate |
| Methanol | Reanal | 20740-0-08-65 | |
| Propylene glycol | Reanal | 08860-1-08-65 | |
| Dimethyl sulfoxide | Reanal | 00190-1-01-65 | |
| Collagenase | Gibco | 9001-12-1 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8003 | |
| DNase I | Panreac AppliChem | A3778 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | Tablets for preparation of 200 ml PBS solution |
Referências
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