Frysförvaring av zebrafisk spermatogonier av hela testiklarna nål nedsänkt Ultra snabb kylning
Summary
Det huvudsakliga syftet med denna studie var att anpassa nålen nedsänkt förglasning (NIV) förfarandet för att frysa hela zebrafiskar testiklarna. Dessutom testades repeterbarheten av metod i fem olika zebrafiskar stammar.
Abstract
Aktuella trender inom naturvetenskap och bioteknik leda till skapandet av tusentals nya linjer i modellorganismer som därmed leder till behovet av nya metoder för säker förvaring av genetiska resurser utöver de gemensamma metoderna för att hålla häckningskolonier. Det huvudsakliga syftet med denna studie var att anpassa nålen nedsänkt förglasning (NIV) förfarandet för att frysa hela zebrafiskar testiklarna. Frysförvaring av tidigt stadium könsceller av hela testiklarna NIV erbjuder möjligheter för förvaring av zebrafisk genetiska resurser, särskilt eftersom efter transplantation kan de mogna till både manliga och kvinnliga könsceller. Testiklarna var censurerade, fäst på en akupunktur nål, jämviktas i två cryoprotective media (Jämviktstiden lösning innehållande 1,5 M metanol och 1,5 M propylenglykol; och förglasning lösning innehållande 3 M dimetyl sulfoxid och 3 M propylenglykol) och slungades in i flytande kväve. Prover värmdes i en serie av tre åtföljande värmande lösningar. De främsta fördelarna med denna teknik är (1) avsaknaden av spermier efter rötning av värmde testiklarna vilket underlättar nedströms manipulationer; (2) Ultra snabb nedkylning möjliggör optimal exponering av vävnader till flytande kväve därför maximera kylning och att minska den nödvändiga koncentrationen av cryoprotectants, vilket minskar deras toxicitet. (3) synkrona exponering för flera testiklarna cryoprotectants och flytande kväve; och (4) repeterbarhet visat genom att erhålla bärkraft över 50% i fem olika zebrafiskar stammar.
Introduction
Nya trender inom naturvetenskap och bioteknik har lett till skapandet av tusentals nya mutant rader av möss, Drosophila, zebrafiskar och andra arter som används som modellorganismer i biomedicinsk och andra vetenskaper1. Dessutom som nya tekniker utvecklas och blir tillgängliga, öka numrerar av muterade linjer stadigt2. Detta leder till nödvändigheten för en säker förvaring av genetiska resurser utöver de gemensamma metoderna för att hålla häckningskolonier. Som en metod som möjliggör säker förvaring av genetiska resurser på obestämd tid, frysförvaring erbjuder många fördelar som förlängning av reproduktiva säsong, kringgår behovet av fortlöpande underhåll av avelsbestånd, och det är mer kostnads – och Labor-effektiv2.
Protokoll för spermier frysförvaring utvecklats under de senaste flera år2,3,4 erbjuder möjlighet till framgångsrik lagring av zebrafisk manliga genetiskt material. Dock ännu Frysförvaring av ägg eller embryon i fisk inte möjligt på grund av deras komplexa struktur och stora mängder äggula material. Nyligen, öva av transplantation av primordiala könsceller (PGCs) eller spermatogoniala stamceller (SSCs) erbjuder en bypass till denna barriär genom att utveckla till funktionella spermier och ägg efter transplantation5. Frysförvaring av SSCs erbjuder därför en ny gräns i bevarande av sällsynta och värdefulla genetiska resurser.
Även om frysförvaring erbjuder många fördelar, genererar långsam-rate frysprocessen flera tillstånd som kan leda till cell skada2. Dessa inkluderar intracellulär och extracellulär isbildning, dehydrering, frysskyddmedel toxicitet och andra. Intracellulära is skadar cellerna, extracellulär is kan leda till mekanisk krossning av celler, medan vatten diffusion från cellerna under långsam-rate frysning kan leda till uttorkning6. Nyligen, förglasning som en teknik som förhindrar de negativa effekterna av isbildande har tillämpats i frysförvaring fisk könsceller7,8,9. Den presenterar en ultra snabb kylning teknik genom vilka interna och externa media förvandlas till ett amorft/glasartad tillstånd utan crystalizing till is7,10. Framgångsrika förglasning av testikelcancer och äggstockscancer vävnad har varit framgår i fågelinfluensa och däggdjur arter10,11,12, vilket öppnar möjligheter för dess tillämpning i fisk, liksom.
I denna studie presenterar vi nål nedsänkt förglasning (NIV) förfarandet för Frysförvaring av hela zebrafiskar testiklarna. Vi visar en pålitlig metod för isolering av zebrafisk tidigt stadium könsceller utan kontaminering och frysförvaring process som ger relativt höga mängder tidigt stadium könsceller med en låg förekomst av andra celler, särskilt spermier. Bäst av vår kunskap är detta den första studien som visar en detaljerad visualiserade protokoll för Ultra snabb kylning av fisk gonadala vävnad och zebrafiskar könsceller celler. Dessutom repeterbarhet av metoden demonstreras i fem olika zebrafiskar stammar: AB vildtyp, casper (roy– / –; pärlemor– / –), leopard (leot1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] och Wilms tumör [Tg (wt1b::eGFP 1)] transgena linje.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det huvudsakliga syftet med denna studie var att anpassa nålen nedsänkt Ultra snabb kylning förfarandet utvecklats för fågelinfluensa och däggdjur arter10,11,12 till Frysförvaring av fisk testiklarna (zebrafiskar som modell organism). De flesta tidigare studier angående Frysförvaring av zebrafisk genetiska resurser var främst inriktad på Frysförvaring av zebrafisk spermier2,<sup cla…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av nationell forskning, utveckling och Innovation Office av Ungern (grant 116912 att ÁH), det COST-kontoret (mat och jordbruk kostnad åtgärd FA1205: AQUAGAMETE), det Stipendium ungerska stipendieprogrammet (grant till ZM) och ny Ungerska National Excellence pre Fellowship (grant till EK).
Materials
| Leibovitz media (L-15) | Sigma-Aldrich | L1518 | Supplemented with L-glutamine |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Trehalose | Acros Organics | 99-20-7 | Dihydrate |
| Methanol | Reanal | 20740-0-08-65 | |
| Propylene glycol | Reanal | 08860-1-08-65 | |
| Dimethyl sulfoxide | Reanal | 00190-1-01-65 | |
| Collagenase | Gibco | 9001-12-1 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8003 | |
| DNase I | Panreac AppliChem | A3778 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | Tablets for preparation of 200 ml PBS solution |
Referências
- Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions. Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).
- Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center. Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).
- Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. R. Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio. Theriogenology. 68 (2), 128-136 (2007).
- Morris, J. P., Berghmans, S., Zahrieh, D., Neuberg, D. S., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish sperm cryopreservation with N,N-dimethylacetamide. Biotechniques. 35 (5), 956-968 (2003).
- Yoshizaki, G., et al. Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources. Comp. Biochem. Physiol. Part D: Genomics Proteomics. 6 (1), 55-61 (2011).
- Gao, D., Critser, J. K. Mechanisms of cryoinjury in living cells. ILAR J. 41 (4), 187-196 (2000).
- Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, &. #. 1. 9. 3. ;. Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review. Gen. Comp. Endocrinol. 245, 69-76 (2017).
- Kása, E., et al. Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla). Gen. Comp. Endocrinol. 245, 102-107 (2017).
- Cuevas-Uribe, R., Leibo, S. P., Daly, J., Tiersch, T. R. Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non-equilibrium cooling. Cryobiology. 63 (3), 186-197 (2011).
- Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation. Hum. Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2008).
- Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. Production of Live Offspring from Testicular Tissue Cryopreserved by Vitrification Procedures in Japanese Quail (Coturnix japonica). Biol. Reprod. 88 (5), 124 (2013).
- Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica). Anim. Reprod. Sci. 134 (3-4), 197-202 (2012).
- Lee, S., Yoshizaki, G. Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok). Cryobiology. 72 (2), 165-168 (2016).
- Marques, L. S., et al. Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container. Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).
- Lujić, J., et al. First successful vitrification of salmonid ovarian tissue. Cryobiology. 76, 154-157 (2017).
- Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., García-Ximénez, F. Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods. CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).
- Marinović, Z., et al. Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing. Gen. Comp. Endocrinol. 245, 77-83 (2017).
- Pšenička, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B. Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells. Cryobiology. 72, 119-122 (2016).
- Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).
