In Situ MHC-tetrâmero manchando e análise quantitativa para determinar a localização, abundância e fenótipo de células T de CD8 antígeno-específicas em tecidos

Resumo

Aqui, descrevemos um método que combina em situ MHC-tetrâmero coloração com imuno-histoquímica para determinar a localização, fenótipo e a quantidade de pilhas de T antígeno-específicos nos tecidos. Este protocolo é usado para determinar as características espaciais e fenotípicas de células T CD8 de antígeno-específicas em relação a outro tipo de célula e estruturas nos tecidos.

Resumo

As células T são essenciais para muitos processos imunológicos, incluindo a detectar e eliminar as células infectadas por vírus, evitando a auto-imunidade, auxiliando na produção de células B e células plasmáticas de anticorpos e detectar e eliminar as células cancerosas. O desenvolvimento do MHC-tetrâmero de coloração de células T antígeno-específicas, analisadas por citometria de fluxo tem revolucionado a nossa capacidade de estudar e compreender o immunobiology de células T. Embora extremamente útil para a determinação da quantidade e do fenótipo das células de T antígeno-específicas, citometria de fluxo não é possível determinar a localização espacial de pilhas de T antígeno-específicas de outras células e estruturas em tecidos e técnicas atuais de desagregação para extrair o T células necessárias para citometria de fluxo têm limitado eficácia em tecidos não-linfoides. In situ MHC-tetrâmero coloração (IST) é uma técnica para visualizar as células T que são específicas para os antígenos de interesse em tecidos. Em combinação com imuno-histoquímica (IHC), IST pode determinar a abundância, localização e fenótipo das células CD8 e CD4 T de antígeno-específicas em tecidos. Aqui, descrevemos um protocolo para manchar e enumerar as células T CD8 de antígeno-específicas, com fenótipos específicos localizados dentro de compartimentos de tecido específico. Estes procedimentos são as mesmas que usamos em nossa recente publicação por Li et al, intitulado "células produtoras de Simian vírus da imunodeficiência em folículos são parcialmente suprimidos pelo CD8 células⁺ In Vivo." Os métodos descritos são amplamente aplicáveis, porque pode ser usados para localizar, fenótipo e quantificar essencialmente qualquer célula T CD8 antígeno-específicos para os quais tetrâmeros MHC estão disponíveis, em qualquer tecido.

Introdução

As células T são essenciais para muitos processos imunológicos, incluindo a detectar e eliminar as células infectadas por vírus, evitando a auto-imunidade, auxiliando na produção de células B e células plasmáticas de anticorpos e detectar e eliminar as células cancerosas. O desenvolvimento de peptídeo/MHC classe I tetrâmero coloração de antígeno-específicas¹ as células T CD8 e o mais recente desenvolvimento de MHC classe II tetrâmero coloração de células T CD4² por citometria de fluxo revolucionou a nossa capacidade de estudar e compreender o Immunobiology de células T. Embora extremamente útil para a determinação da qua....

Protocolo

1. dia 1: corte de tecido fresco e incubação primário

1. uso um bisturi para cortar o tecido fresco em pedaços pequenos (aproximadamente 0,5 cm de largura por 0,5 cm de altura). Separadamente cada tecido para um êmbolo de cola e incorporá-los com 3-5 mL de agarose de baixo ponto de fusão de 4% em PBS. Rotule o êmbolo com a informação do tecido usando um adesivo. Colocá-lo em um suporte refrigerado em um balde de gelo para solidificar o.
2. Ativar o micrótomo e defina a espessura das seções a 200 µm. Instale uma lâmina de barbear o micrótomo e insira o êmbolo montada com tecido no banho de micrótomo.
3. Preparar o tampão fosfato salino com heparin....

Resultados

A Figura 1 mostra como coletar imagens confocal, usando um microscópio confocal. A Figura 2 demonstra a análise quantitativa de imagem usando o ImageJ. Figuras 3 e 4 mostram representante imagens dos tecidos do nó de linfa de uma SIV infectado macaque do rhesus manchado com tetrâmeros de MHC e CD8 anticorpos anticorpos CD20 e servem para demonstrar a especificidade da MHC-tetrâmero de coloração. .......

Discussão

IST combinada com IHC fornece uma ferramenta essencial para detectar, caracterizar e quantificar as células T CD8 de antígeno-específicas em ambientes nativos com o contexto de outras células e estruturas do tecido. Aqui, descrevemos os procedimentos detalhados para IST combinada com IHC, seguido de análise quantitativa de imagem, para determinar a localização, abundância e fenótipo de células T CD8 de antígeno-específicas em linfonodos de macacos rhesus. Coloração semelhante pode ser aplicada ao ser humano, rato, ou out.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
	central de tetrâmero de	monômero MHC-I	NIH Materiais para preparação de MHC-tetrâmero
ExtrAvidin-FITC	Sigma-Aldrich	E2716	Materiais para preparação de MHC-tetrâmero
Soro de cabra normal	Jackson Immunoresearch	005-000-121
Baixa agasse	de fusão Promega	V3121
Heparina	Sigma-Aldrich
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-6878
Ureia	J.T.Baker	4204-05
Gelatina de glicerol	Sigma-Aldrich	SLBH2672V
galato de n-propila	Sigma-Aldrich	P3130
rat-a-h-CD8 (1:500)	Acris	0714	Anticorpo instável, use alíquota
m-a-h-CD20 (1:500)	NOVOCASTRA	6026819
m-a-h-Ki67 (1:500)	Vector	6022201
cabra-a-m-A488 (1:2.000)	Jackson Immunoresearch	124083
cabra-a-rb-Cy3 (1:5.000)	Jackson Immunoresearch	106232
cabra-a-rato-Cy5 (1:5.000)	Jackson Immunoresearch	118088
goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5,000)	Jackson Immunoresearch	86579
Compresstome: VF-300 Microtome	Precisionary Instruments, LLC	1079
Quick Set Instant Adhesive	Loctite	46551
Placas de cultura de tecidos de fundo plano de 24 poços	Falcon	353226
Lâmina de microscópio	Globe scienfitic Inc.	#1321
Lâmina de barbear	Ted Pella, Inc	121-6
Bisturi descartável de penas	FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD.	No. 21
Pincel redondo # 2	PRINCETON ART & ESCOVA CO.	4350R	Pode aparar conforme necessário com navalha
Microscópio Confocal	Olympus	FV1000
FV10-ASW_Viewer4.0	Olympus

Instalação SLBL6391Vcongelada de uso único