בחיי עיר MHC-tetramer מכתים וניתוח כמותי כדי לקבוע את מיקום שפע, ותפקיד של אנטיגן ספציפי CD8 T תאים ברקמות
Summary
כאן, אנו מתארים שיטה המשלבת בחיי עיר MHC-tetramer מכתים עם אימונוהיסטוכימיה כדי לקבוע לוקליזציה, פנוטיפ וכמות תאי T אנטיגן ספציפי ברקמות. פרוטוקול זה משמש כדי לקבוע את המאפיינים המרחבי, פנוטיפי של אנטיגן ספציפי בתאי CD8 T ביחס אחרים סוג התא ומבני ברקמות.
Abstract
תאי T הם קריטיים לתהליכים אימונולוגי רבים, לרבות גילוי ו חיסול תאים הנגועים בנגיף, מניעת מחלת חיסון עצמי, סיוע בייצור תאי B ו פלזמה-cell של נוגדנים, איתור של חיסול תאים סרטניים. הפיתוח של MHC-tetramer מכתים של תאי T אנטיגן ספציפי נותחו על ידי cytometry זרימה יש מהפכה היכולת שלנו ללמוד ולהבין את immunobiology של תאי T. בזמן מאוד שימושי לקביעת כמות של פנוטיפ של תאי T אנטיגן ספציפי, cytometry זרימה אין אפשרות לקבוע את ההתאמה המרחבית של אנטיגן ספציפי בתאי T תאים אחרים, מבנים רקמות וטכניקות disaggregation הנוכחי כדי לחלץ את ה-T תאים הדרושים עבור cytometry זרימה מוגבלת ברקמות שאינן הלימפה. בחיי עיר MHC-tetramer מכתים (IST) היא טכניקה להמחיש T תאים ספציפיים עבור אנטיגנים עניין ברקמות. בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה (IHC), IST ניתן לקבוע את השפע, מה מיקומם ואילו פנוטיפ של אנטיגן ספציפי תאי CD8 ו- CD4 T ברקמות. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול כדי להכתים ולספור תאי CD8 T אנטיגן ספציפי, עם פנוטיפים ספציפי ממוקם בתוך תאי רקמות ספציפיות. הליכים אלה זהים פעם בפרסום האחרונה שלנו מאת Li. et al., שכותרתו “תאים מייצרי בנגיף זקיקים מדוכאים באופן חלקי על ידי CD8+ תאים Vivo ב.” בשיטות המתוארות חלים באופן כללי כי הם יכולים לשמש כדי להתאים לשפה, פנוטיפ, ולכמת למעשה כל אנטיגן ספציפי CD8 תא T שעבורו MHC tetramers זמינים, כל רקמה.
Introduction
תאי T הם קריטיים לתהליכים אימונולוגי רבים, לרבות גילוי ו חיסול תאים הנגועים בנגיף, מניעת מחלת חיסון עצמי, סיוע בייצור תאי B ו פלזמה-cell של נוגדנים, איתור של חיסול תאים סרטניים. הפיתוח של פפטיד/MHC מחלקה אני tetramer מכתים של אנטיגן ספציפי CD8 T תאים1 , התפתחות עדכנית יותר של MHC class II tetramer מכתימה של תאי CD4 T2 מאת cytometry זרימה מהפכה היכולת שלנו ללמוד ולהבין immunobiology של תאי T. בזמן מאוד שימושי לקביעת כמות של פנוטיפ של תאי T אנטיגן ספציפי, cytometry זרימה אינו מאפשר איתור לוקליזציה המרחבי של אנטיגן ספציפי בתאי T כדי תאים ומבנים אחרים ברקמות, ועדכניים disaggregation טכניקות כדי לחלץ את תאי T הדרושים עבור cytometry זרימה מוגבלת רקמות הלימפה3.
אנחנו ואחרים פיתחו שיטות שימוש טעון-פפטיד MHC class אני ו class II tetramer או multimer ריאגנטים כתם תאי CD8 ו- CD4 T אנטיגן ספציפי רקמות4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. שיטות אלה IST לאפשר הקביעה של מיקום, שפע, ותפקיד של CD8 אנטיגן ספציפי ותאי CD4 T ברקמות ולספק אמצעי לגילוי של תאים אלה ביחס תאים ומבנים אחרים ברקמות. הקבוצה שלנו השתמשה בהרחבה MHC-אני tetramer מכתים ללמוד וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) – וגם הקופי הכשל החיסוני (SIV) – תאי CD8 T ספציפיים ברקמות הלימפה, איברי המין, פי הטבעת כדי להשיג הבנה של השיגה SIV ו- HIV כדי לזהות בקורלציה של חיסון מוצלחת אסטרטגיות14,15,16,17. בנוסף, אנו גם פיתחו טכניקה שמשלב IST בבאתרו הכלאה (איש) כדי להתאים לשפה ולכמת בתאי CD8 T וירוס ספציפיים, תאים הנגועים בנגיף ברקמות וכדי לקבוע את רמות אפקטור-כדי-יעד ויוו 18 , 19.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול באמצעות טעון-פפטיד MHC-אני tetramers כתם אנטיגן ספציפי בתאי CD8 T בסעיפים רקמות טריים, עד counterstain רקמות באמצעות IHC ולאחר לכמת תאים עם פנוטיפים ספציפי בתאים רקמות ספציפיות. הליכים אלה הם בדיוק כמו Li. et al., שבו קבענו את מיקום שפע, ותפקיד של תאי T ספציפי SIV ברקמת הלימפה במהלך זיהום כרוני SIV קופי מקוק20שימש בפרסום האחרונה שלנו.
עבור הליך זה, רקמות טריים למחלקה, מודגרות בין לילה עם טעון-פפטיד MHC-אני tetramers מצומדת כדי מולקולות thiocyanate fluorescein (FITC). ואז הם קבועים ב- paraformaldehyde. לאחר תיקון הרקמה, האיתות tetramers MHC מוגבר באמצעות נוגדנים anti-FITC הארנב, מודגרות עם מתויגות fluorescently הארנב אנטי איג נוגדנים, נוסף להיקלט. מ tetramers מאוגד. IHC משמש בשילוב עם IST לאפיין אנטיגן ספציפי T תאים, התאים שמסביב. נוגדנים מזהה epitopes על פני השטח של תאים או בחלל חוץ-תאית כלולים הדגירה העיקרי עם tetramers. נוגדנים מזהה תאיים epitopes דורשים הסתננות של דופן התא לפני צביעת. הסעיפים רקמות מוכתמים הם צילמו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי וניתח באמצעות תוכנה קונפוקלי. תאים עם תוויות הם לכמת באמצעות תוכנה מיקרוסקופיה קונפוקלית או ImageJ. הפרוטוקול המתואר יכול לשמש כדי להכתים בעיקרו אנטיגן ספציפי CD8 T תא כלשהו ברקמה כלשהי עבור אילו MHC-אני tetramers הינם זמינים.
Protocol
Representative Results
Discussion
IST בשילוב עם IHC מספק כלי חיוני עבור זיהוי, אפיון לכימות אנטיגן ספציפי בתאי CD8 T בסביבות מקורית עם ההקשר של תאים ומבנים רקמות אחרות. כאן, אנו המתואר הליכים מפורטים עבור IST בשילוב עם IHC, ואחריו ניתוח תמונה כמותית, כדי לקבוע את מיקום שפע, ותפקיד של אנטיגן ספציפי בתאי CD8 T בבלוטות הלימפה של קופי מקוק …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי שירותי הבריאות הציבוריים מעניקה מ מכוני הבריאות הלאומיים (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).
Materials
| MHC-I monomer | NIH tetramer core facility | Materials for MHC-tetramer preparation | |
| ExtrAvidin-FITC | Sigma-Aldrich | E2716 | Materials for MHC-tetramer preparation |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Low melt agarose | Promega | V3121 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | SLBL6391V | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-6878 | |
| Urea | J.T.Baker | 4204-05 | |
| Glycerol/gelatin | Sigma-Aldrich | SLBH2672V | |
| n-propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| rat-a-h-CD8 (1:500) | Acris | 0714 | Antibody unstable, use single use frozen aliquot |
| m-a-h-CD20 (1:500) | NOVOCASTRA | 6026819 | |
| m-a-h-Ki67 (1:500) | Vector | 6022201 | |
| goat-a-m-A488 (1:2000) | Jackson Immunoresearch | 124083 | |
| goat-a-rb-Cy3 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 106232 | |
| goat-a-rat-Cy5 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 118088 | |
| goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 86579 | |
| Compresstome: VF-300 Microtome | Precisionary Instruments, LLC | 1079 | |
| Quick Set Instant Adhesive | Loctite | 46551 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon | 353226 | |
| Microscope slide | Globe scienfitic Inc. | #1321 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc | 121-6 | |
| Feather Disposable Scalpel | FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD. | No. 21 | |
| Round paintbrush #2 | PRINCETON ART & BRUSH CO. | 4350R | Can trim as needed with razor |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| FV10-ASW_Viewer4.0 | Olympus |
Referências
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenza A antigen. J Clin Invest. 104, R63-R67 (1999).
- Steinert, E. M., et al. Quantifying memory CD8 T cells reveals regionalization of immunosurveillance. Cell. 161 (4), 737-749 (2015).
- Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
- Haanen, J. B., et al. In situ detection of virus- and tumor-specific T-cell immunity. Nat Med. 6 (9), 1056-1060 (2000).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining using MHC class I tetramers. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. 17, 4.1-4.9 (2004).
- Li, Y., et al. Use of HLA-DR*08032/E7 and HLA-DR*0818/E7 tetramers in tracking of epitope-specific CD4+ T cells in active and convalescent tuberculosis patients compared with control donors. Immunobiology. 216, 947-960 (2011).
- Bischof, F., et al. Analysis of autoreactive CD4 T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis after primary and secondary challenge using MHC class II tetramers. J Immunol. 172, 2878-2884 (2004).
- Massilamany, C., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS ONE. 9, e87519 (2014).
- Massilamany, C., et al. In situ detection of autoreactive CD4 T cells in brain and heart using major histocompatibility complex class II dextramers. J Vis Exp. (90), e51679 (2014).
- Dileepan, T., Kim, H. O., Cleary, P. P., Skinner, P. J. In Situ Peptide-MHC-II Tetramer Staining of Antigen-Specific CD4+ T Cells in Tissues. PLoS ONE. 10 (6), e0128862 (2015).
- Tjernlund, A., et al. In situ detection of Gag-specific CD8+ cells in the GI tract of SIV infected Rhesus macaques. Retrovirology. 7, 7-12 (2010).
- Connick, E., et al. CTL fail to accumulate at sites of HIV-1 replication in lymphoid tissue. J Immunol. 178, 6975-6983 (2007).
- Hong, J. J., et al. Localized Populations of CD8low/− MHC Class I Tetramer+ SIV-Specific T Cells in Lymphoid Follicles and Genital Epithelium. PLoS ONE. 4 (1), e4131 (2009).
- Sasikala-Appukuttan, A. K., et al. Location and dynamics of the immunodominant CD8 T cell response to SIVΔnef immunization and SIVmac251 vaginal challenge. PLoS ONE. 8 (12), e81623 (2013).
- Connick, E., et al. Compartmentalization of simian immunodeficiency virus replication within secondary lymphoid tissues of rhesus macaques is linked to disease stage and inversely related to localization of virus-specific CTL. J Immunol. 193, 5613-5625 (2014).
- Li, Q., et al. Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcomes in early viral infection. Science. 323, 1726-1729 (2009).
- Li, Q., Skinner, P. J., Duan, L., Haase, A. T. A technique to simultaneously visualize virus-specific CD8+ T cells and virus-infected cells in situ. J Vis Exp. (30), e1561 (2009).
- Li, S., et al. Simian immunodeficiency virus-producing cells in follicles are partially suppressed by CD8+ cells in vivo. J Virol. 90, 11168-11180 (2016).
- Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. J Exp Med. 191, 335-346 (2000).
- Lee, Y. J., Wang, H., Starrett, G. J., Phuong, V., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Tissue specific distribution of iNKT cells impacts their cytokine response. Immunity. 43 (3), 566-578 (2015).
- Abdelaal, H. M., Kim, H. O., Wagstaff, R., Sawahata, R., Southern, P. J., Skinner, P. J. Comparison of Vibratome and Compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining. Biol Proced Online. 17, (2015).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
