Summary

その場でMHC テトラマー染色と場所、豊富と組織における抗原特異的 cd8 陽性 T 細胞の表現型を決定するための定量解析

Published: September 22, 2017
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Summary

ここでは、免疫組織化学的局在、表現型、組織における抗原特異的 T 細胞の量を決定するとその場でMHC テトラマー染色を組み合わせた手法について述べる。このプロトコルは、他のセルの種類および組織の構造を基準にして抗原特異的 CD8 T 細胞の表現型特性を決定する使用です。

Abstract

T 細胞の検出やウイルス感染細胞を排除すること、自己免疫疾患を防止する抗体と検出し、がん細胞を排除する B 細胞や形質細胞の生産の支援など、多くの免疫学的プロセスに重要です。フローサイトメトリーで分析した抗原特異的 T 細胞の MHC テトラマー染色の開発研究し、T 細胞の免疫生物学を理解する当社の能力をもたらしました。フローサイトメトリーは、抗原特異的 T 細胞を他の細胞や組織、および現在の分解技術の構造の空間定位を判断できない量と抗原特異的 T 細胞の表現型を決定する非常に便利ですが、T を抽出するセル必要とフローサイトメトリー限られている非リンパ系組織の有効性。その場でMHC テトラマー染色 (IST) は、組織の興味の抗原のために特定が T 細胞を可視化する手法です。免疫組織染色 (IHC) と組み合わせて、IST は、豊かさ、場所、および組織における抗原特異的 CD8 と CD4 T 細胞の表現型を決定できます。ここでは、染色し、特定の組織のコンパートメント内にある特定の表現型を持つ抗原特異的 CD8 T 細胞を列挙するプロトコルについて述べる.これらの手順は、李、権利によって我々 の最近の出版物で使用した同じ「卵胞は CD8 によって抑制されます部分的にサル免疫不全ウイルス産生細胞細胞の+ In Vivo。」説明する方法は、彼らは、表現型のローカライズに使用することができ、本質的に、抗原特異的 CD8 T 細胞 MHC テトラマーは任意の組織で利用可能なを定量化に広範に適用されます。

Introduction

T 細胞の検出やウイルス感染細胞を排除すること、自己免疫疾患を防止する抗体と検出し、がん細胞を排除する B 細胞や形質細胞の生産の支援など、多くの免疫学的プロセスに重要です。ペプチド/MHC のクラス I のテトラマー CD8 T 細胞の抗原特異的染色1と MHC クラス II 四量体染色の CD4 T 細胞2のフローサイトメトリーによる最近の開発研究し、理解する当社の能力に革命をもたらしました、T 細胞の免疫生物学。量と抗原特異的 T 細胞の表現型を決定する非常に便利ですが、他の細胞や組織、現在構造に抗原特異的 T 細胞の空間定位の検出でフローサイトメトリーは、します。T 細胞を抽出する分解テクニック必要フローサイトメトリー限られている非リンパ系組織3で有効性。

私たちと他の人は私とクラス II 四量体や多量体試薬ペプチド負荷 MHC のクラスを使用して組織4,5,6,7,抗原特異的 CD8 および CD4 T 細胞を染色する方法を開発しました。8,9,10,11,12,13。 これら IST メソッドの場所、豊富、と組織における抗原特異的 CD8 と CD4 T 細胞の表現型の定量を可能にすると、他の細胞や組織の構造を基準にしてこれらの細胞を検出する手段を提供します。当社グループは、広く MHC を使用います-私四量体でひと免疫不全ウイルス (HIV) – とサル免疫不全ウイルス (SIV) – 染色 HIV と SIV の免疫病態の理解を得るためにリンパ、生殖器、直腸の組織における特定の CD8 T 細胞成功した予防接種戦略14,15,16,17の関連要因を識別します。さらに、組織と生体内でエフェクタ-ターゲット レベルを決定する我々 はもイストを組み合わせたものの in situハイブリダイゼーション (っぽい) をローカライズし、ウイルス特異的 cd8 陽性 T 細胞、ウイルス感染細胞を定量化する技術を開発しました。18,19

ここでは、用いたペプチド負荷プロトコルについて述べる-私テトラマー IHC を使用して対比染色組織に新鮮な組織切片の抗原特異的 CD8 T 細胞を染色して特定の組織コンパートメントにおける特定の表現型と細胞を定量化します。これらの手順は、李、慢性 SIV 感染サル20時、場所、豊富とリンパ組織における SIV 特異的 T 細胞の表現型を決定私たちによる私たちの最近の出版物で使用されたと同じです。

この手順では、新鮮な組織を断面し、ペプチド負荷 MHC で夜通し孵化-私テトラマー共役フルオレセイン チオシアン酸分子 (FITC)。彼らは、パラホルムアルデヒドで固定されます。組織を固定した後は、ウサギ抗 FITC 抗体を使用し、さらにバインドされたテトラマーからの信号を増幅、蛍光タグの抗うさぎ IgG 抗体とインキュベート MHC テトラマーからの信号は増幅されます。IHC は、抗原特異的 T 細胞と周囲の細胞を特徴付ける IST と組み合わせて使用です。細胞外空間、細胞表面上のエピトープを認識する抗体は、テトラマーとプライマリの孵化に含まれます。細胞エピトープを認識する抗体染色前に細胞壁の透過性が必要です。染色組織切片を共焦点顕微鏡を用いたイメージングが行い共焦点ソフトウェアを使用しています。ラベル付きセルは、共焦点顕微鏡によるソフトウェアや ImageJ を用いた定量化しました。どの MHC の本質的に抗原特異的 CD8 T の任意のセルの任意の組織を染色する記述のプロトコルを使用できます-私テトラマーがあります。

Protocol

1 です。 一日 1: 新鮮なティッシュの区分と主なインキュベーション 使用メス小 (約 0.5 センチ幅 0.5 cm 背の高い) 部分に新しいティッシュをカットします。別にプランジャーを各組織を接着し、4% 低溶解アガロースの 3-5 mL の PBS に埋め込みます。ステッカーを使用して組織情報にプランジャーをラベルします。固めるため氷バケットにチルド ホルダーに入れています。 ミクロ…

Representative Results

図 1は、共焦点顕微鏡を用いた共焦点画像を収集する方法を示します。図 2は、ImageJ を用いた定量的画像解析を示しています。図 3と4 SIV からリンパ節組織の画像感染アカゲザル MHC テトラマー、CD8 抗体、CD20 抗体で染色代表を示すし、MHC テトラマー染色の特異性を示すためになります。<strong class=…

Discussion

IHC と組み合わせて IST は、検出、特性評価、および他の細胞や組織構造のコンテキストでネイティブ環境での抗原特異的 CD8 T 細胞の定量化のために不可欠なツールを提供します。ここでは、イストの IHC、定量的画像解析に続いての場所、豊富とアカゲザルからリンパ節における抗原特異的 CD8 T 細胞の表現型を決定するために結合用の詳細な手順を説明します。ヒトに応用マウス、またはど?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作業によって支えられた公衆衛生サービスを健康の国民の協会 (T32 DA007097、R01AI096966、andUM1AI26617) から付与します。

Materials

MHC-I monomer NIH tetramer core facility Materials for MHC-tetramer preparation
ExtrAvidin-FITC Sigma-Aldrich E2716 Materials for MHC-tetramer preparation
Normal goat serum Jackson Immunoresearch 005-000-121
Low melt agarose Promega V3121
Heparin Sigma-Aldrich SLBL6391V
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-6878
Urea J.T.Baker 4204-05
Glycerol/gelatin Sigma-Aldrich SLBH2672V
n-propyl gallate Sigma-Aldrich P3130
rat-a-h-CD8 (1:500) Acris 0714 Antibody unstable, use single use frozen aliquot
m-a-h-CD20 (1:500) NOVOCASTRA 6026819
m-a-h-Ki67 (1:500) Vector 6022201
goat-a-m-A488 (1:2000) Jackson Immunoresearch 124083
goat-a-rb-Cy3 (1:5000) Jackson Immunoresearch 106232
goat-a-rat-Cy5 (1:5000) Jackson Immunoresearch 118088
goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5000) Jackson Immunoresearch 86579
Compresstome: VF-300 Microtome Precisionary Instruments, LLC 1079
Quick Set Instant Adhesive Loctite 46551
24-well flat bottomed tissue culture plates Falcon 353226
Microscope slide Globe scienfitic Inc. #1321
Razor  blade Ted Pella, Inc 121-6
Feather Disposable Scalpel FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD. No. 21
Round paintbrush #2 PRINCETON ART & BRUSH CO. 4350R Can trim as needed with razor
Confocal Microscope Olympus FV1000
FV10-ASW_Viewer4.0 Olympus

Referências

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Li, S., Mwakalundwa, G., Skinner, P. J. In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues. J. Vis. Exp. (127), e56130, doi:10.3791/56130 (2017).

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