Summary

In Situ La tinción de tetrámero de MHC y análisis cuantitativo para determinar la localización, abundancia y fenotipo de células de T CD8 específica de antígeno en los tejidos

Published: September 22, 2017
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Summary

Aquí, describimos un método que combina en situ MHC tetramer tinción con inmunohistoquímica para determinar localización, fenotipo y cantidad de antígenos específicos de células T en los tejidos. Este protocolo se utiliza para determinar las características espaciales y fenotípicas de las células de T CD8 específica de antígeno con respecto a otro tipo de célula y las estructuras de los tejidos.

Abstract

Las células T son esenciales para muchos procesos inmunológicos, incluyendo la detección y eliminación de células infectadas por virus, previniendo autoinmunidad, ayudando en la producción de células B y células plasmáticas de anticuerpos y detectar y eliminar las células cancerosas. El desarrollo de la tinción de tetrámero de MHC de las células antígeno específicas analizadas por citometría de flujo ha revolucionado nuestra capacidad para estudiar y comprender la Inmunobiología de las células. Mientras que extremadamente es útil para determinar la cantidad y el fenotipo de las células T específicas de antígeno, citometría de flujo no puede determinar la localización espacial de las células a otras células y estructuras de los tejidos y las técnicas actuales de desagregación específica de antígeno para extraer la T las células necesitan para citometría de flujo han limitado eficacia en tejidos no linfoides. In situ Tinción de MHC-tetrámero (IST) es una técnica para visualizar las células T que son específicas para antígenos de interés en los tejidos. En combinación con inmunohistoquímica (IHQ), IST puede determinar la abundancia, la ubicación y el fenotipo de las células CD8 y CD4 T específica de antígeno en los tejidos. Aquí, describimos un protocolo para manchar y para enumerar las células de T CD8 específica de antígeno, con fenotipos específicos ubicados dentro de compartimientos de tejido específico. Estos procedimientos son los mismos que utilizamos en nuestra reciente publicación por Li et al., titulado “las células productoras de Virus Simian de la inmunodeficiencia en los folículos se suprimen parcialmente por CD8 células+ en Vivo.” Los métodos descritos son ampliamente aplicables ya que se pueden utilizar para localizar, fenotipo y cuantificar esencialmente cualquier célula T CD8 específica de antígeno para el cual tetrámeros de MHC están disponibles, en cualquier tejido.

Introduction

Las células T son esenciales para muchos procesos inmunológicos, incluyendo la detección y eliminación de células infectadas por virus, previniendo autoinmunidad, ayudando en la producción de células B y células plasmáticas de anticuerpos y detectar y eliminar las células cancerosas. El desarrollo del péptido/MHC clase I tetrámero tinción de antígenos específicos de las células T CD81 y el más reciente desarrollo de MHC clase II la tinción de tetrámero de T CD4 células2 por citometría de flujo revolucionó nuestra capacidad para estudiar y comprender la Inmunobiología de las células. Mientras que extremadamente es útil para determinar la cantidad y el fenotipo de las células T específicas de antígeno, citometría de flujo no permite la detección de la localización espacial de las células antígeno específicas a otras células y estructuras en los tejidos y actual técnicas de desagregación para extraer las células T necesitan para citometría de flujo han limitado eficacia en tejidos no linfoides3.

Nosotros y otros hemos desarrollado métodos cargados de péptido MHC de clase I y clase tetrámero II multimer reactivos o para teñir las células CD8 y CD4 T específica de antígeno en los tejidos4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. IST estos métodos permiten la determinación de la localización, abundancia y fenotipo de las células CD8 y CD4 T específica de antígeno en los tejidos y proporcionar un medio para la detección de estas células en comparación con otras células y estructuras en los tejidos. Nuestro grupo ha utilizado extensivamente la MHC-I tetrámero tinción para estudio de virus de inmunodeficiencia humana (VIH) – y virus de la inmunodeficiencia símica (VIS) – células T CD8 específicas en tejidos linfoides, genitales y rectales para obtener un entendimiento de la inmunopatogénesis del VIH y SIV e identificar correlatos de vacunación exitoso estrategias14,15,16,17. Además, también desarrollamos una técnica que combina IST con hibridación en situ (ISH) para localizar y cuantificar virus específicos de células T CD8 y células infectadas por virus en los tejidos y para determinar los niveles de efector a destino en vivo 18 , 19.

Aquí, describimos un protocolo usando cargado de péptido MHC-I tetrámeros para teñir las células de T CD8 específica de antígeno en secciones de tejido fresco, hasta tejidos de contratinción con IHC y cuantificar las células con fenotipos específicos en compartimientos de tejido específico. Estos procedimientos son los mismos que fueron utilizados en nuestra reciente publicación por Li et al., en el que se determinaron la localización, abundancia y fenotipo de células T específicas de la SIV en tejido linfoide durante la infección crónica de vis en macacos20.

Para este procedimiento, los tejidos frescos son seccionados y se incubó toda la noche con carga de péptido MHC-I tetrámeros conjugan con moléculas de tiocianato de fluoresceína (FITC). Luego están fijados en paraformaldehido. Después de fijar el tejido, la señal de los tetrámeros de MHC se amplifica usando conejo anti-FITC anticuerpos y se incubaron con fluorescente etiquetados anticuerpos de IgG de Anti-conejos que más amplifican la señal de los tetrámeros encuadernados. IHC se usa junto con IST para caracterizar antígenos específicos de células T y las células circundantes. En la incubación primaria con los tetrámeros se incluyen anticuerpos que reconocen epítopos en la superficie de las células o en el espacio extracelular. Anticuerpos que reconocen epítopos intracelulares requieren permeabilidad de la pared celular antes de la tinción. Las secciones de tejidos teñidos son imágenes con un microscopio confocal y analizan usando el software confocal. Las células marcadas se cuantifican mediante microscopía confocal software o ImageJ. El protocolo descrito se puede utilizar para manchar esencialmente cualquier célula T CD8 específica de antígeno en los tejidos para que MHC-I tetrámeros están disponibles.

Protocol

1. día 1: secciones de tejido fresco e incubación primaria uso de un bisturí para cortar tejido fresco en trozos pequeños (aproximadamente 0,5 cm de ancho por 0,5 cm de altura). Por separado cada tejido de un émbolo del pegamento e incrustarlos con 3-5 mL de agarosa de baja fusión de 4% en PBS. El émbolo de la etiqueta con la información de tejido con una pegatina. Poner en un porta frío en un cubo de hielo para solidificar. Encienda el micrótomo y el espesor de las secciones a 200 μm. Ins…

Representative Results

La figura 1 muestra cómo recopilar imágenes confocales utilizando un microscopio confocal. Figura 2 muestra el análisis de imagen cuantitativo con ImageJ. Figuras 3 y 4 muestran a representante imágenes de tejidos del nodo de linfa de un SIV infectaron macaque del macaco de manchados de tetrámeros de MHC, CD8 anticuerpos y anticuerpos CD20 y sirven para demostrar la especificidad de la tinci…

Discussion

IST combinado con IHC proporciona una herramienta esencial para detectar, caracterizar y cuantificar las células de T CD8 específica de antígeno en ambientes nativos con el contexto de otras células y estructuras del tejido. Aquí, describimos los procedimientos detallados para IST combinado con IHC, seguido por análisis de imagen cuantitativo, para determinar la localización, abundancia y fenotipo de las células de T CD8 específica de antígeno en nodos de linfa de macaques del macaco de la India. Coloración si…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por becas de servicio de salud pública de los institutos nacionales de salud (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).

Materials

MHC-I monomer NIH tetramer core facility Materials for MHC-tetramer preparation
ExtrAvidin-FITC Sigma-Aldrich E2716 Materials for MHC-tetramer preparation
Normal goat serum Jackson Immunoresearch 005-000-121
Low melt agarose Promega V3121
Heparin Sigma-Aldrich SLBL6391V
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-6878
Urea J.T.Baker 4204-05
Glycerol/gelatin Sigma-Aldrich SLBH2672V
n-propyl gallate Sigma-Aldrich P3130
rat-a-h-CD8 (1:500) Acris 0714 Antibody unstable, use single use frozen aliquot
m-a-h-CD20 (1:500) NOVOCASTRA 6026819
m-a-h-Ki67 (1:500) Vector 6022201
goat-a-m-A488 (1:2000) Jackson Immunoresearch 124083
goat-a-rb-Cy3 (1:5000) Jackson Immunoresearch 106232
goat-a-rat-Cy5 (1:5000) Jackson Immunoresearch 118088
goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5000) Jackson Immunoresearch 86579
Compresstome: VF-300 Microtome Precisionary Instruments, LLC 1079
Quick Set Instant Adhesive Loctite 46551
24-well flat bottomed tissue culture plates Falcon 353226
Microscope slide Globe scienfitic Inc. #1321
Razor  blade Ted Pella, Inc 121-6
Feather Disposable Scalpel FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD. No. 21
Round paintbrush #2 PRINCETON ART & BRUSH CO. 4350R Can trim as needed with razor
Confocal Microscope Olympus FV1000
FV10-ASW_Viewer4.0 Olympus

Referências

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Li, S., Mwakalundwa, G., Skinner, P. J. In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues. J. Vis. Exp. (127), e56130, doi:10.3791/56130 (2017).

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