Protocolo do laboratório para análises genéticas de conteúdo intestino de rDNA usando de macroinvertebrados aquáticos grupo-específicos Primers

Summary

Análises de conteúdo de intestino mais comuns de macroinvertebrados são visuais. Exigindo intenso conhecimento sobre diversidade morfológica de organismos de presas, eles falta suave rapina encorpada e, devido à forte cominuição de rapina, são quase impossíveis para alguns organismos, incluindo anfípodes. Nós fornecemos abordagens genéticas detalhadas, a novela de macroinvertebrados presas identificação na dieta de anfípodes.

Abstract

Analisar tróficas é essencial para uma melhor compreensão dos ecossistemas. Por exemplo, comida web interações podem sofrer graves alterações causadas pela invasão de espécies não-nativas. No entanto, a identificação exata das interações predador-presa de campo é difícil em muitos casos. Essas análises são frequentemente baseadas em uma avaliação visual do conteúdo do intestino ou a análise de isótopos estáveis (δ¹⁵N e δ¹³C). Esses métodos exigem conhecimento abrangente sobre, respectivamente, diversidade morfológica ou assinatura isotópica de organismos individuais presas, levando a obstáculos na identificação exata dos organismos de rapina. Análises de conteúdo Visual intestino especialmente subestime organismos suave rapina encorpado, porque maceração, ingestão e digestão de presas organismos dificultam a identificação de espécies específicas. Portanto, estratégias de reação em cadeia (PCR) com base de polimerase, por exemplo o uso de primer grupo específico define, fornecer uma ferramenta poderosa para a investigação de interações web de comida. Aqui, descrevemos protocolos detalhados para investigar o conteúdo do intestino dos consumidores de macroinvertebrados do campo usando conjuntos específicos de grupo primário para ácido desoxirribonucleico de ribosomal nuclear (rDNA). DNA pode ser extraído a partir de espécimes inteiro (no caso de pequenos táxons) ou do conteúdo do intestino de espécimes coletados no campo. Presença e eficiência funcional dos modelos de DNA precisam ser confirmada diretamente do indivíduo testado usar primer universal define visando a respectiva subunidade de DNA. Também demonstramos que presa consumida pode ser determinada mais para baixo ao nível de espécie através de PCR com primers de grupo específicas sem modificações combinadas com análises de polimorfismo (SSCP) conformação subsequente único fio usando géis de poliacrilamida. Além disso, mostramos que o uso de corantes fluorescentes diferentes como rótulos permite rastreio paralelo de fragmentos de DNA de presas diferentes grupos de várias amostras de conteúdo intestino através de análise automatizada de fragmento.

Introduction

Interações predador-presa, que constituem a maioria da comida da web dinâmica e interações tróficas, são aspectos fundamentais para caracterizar os fluxos de matéria e energia ao longo de teias de alimento dentro e entre os ecossistemas, o que é um dos principais objetivos da ecologia ¹. a determinação da fonte e fluxo de carbono e nutrientes é promover a compreensão da conectividade ecológica entre ecossistemas². No entanto, os ecossistemas, tais como rios e suas bacias hidrográficas, não estão ligados somente por fluxos de matéria orgânica e nutrientes, mas também pelos movimentos de organismos³. Assim, alterações de habitat, interrompendo o fluxo de recursos que associam esses sistemas podem fortemente alterar as teias alimentares de ambos os ecossistemas, não só diretamente, mas também indiretamente alterando a respectiva composição das comunidades de predador-presa. Por exemplo, alterações de teias alimentares foram mostradas para ser ligado aos movimentos de predador única espécie (por exemplo, truta arco-íris)⁴. Tais alterações potencialmente ameaçam a biodiversidade e o funcionamento dos ecossistemas aquáticos. Portanto, analisar interações predador-presa no campo é essencial para determinar o impacto das mudanças ambientais induzidas pelo homem, tais como as práticas de gestão de água, sobre a biodiversidade nativa dos ecossistemas aquáticos.

Desde ligações tróficas de rastreamento é difícil em sistemas complexos, várias abordagens foram estabelecidas que permitem a avaliação da alimentação interações no campo⁵. Tradicionalmente, as investigações de interações no campo de alimentação baseiam-se na identificação visual dos restos de presas nas entranhas dissecados e exigem um amplo conhecimento sobre diversidade morfológica presa. Análises de conteúdo Visual intestino forneceram introspecções na utilização dos recursos de vários grupos de consumidores (por exemplo, variação sazonal na dieta de lagosta peixe e^{6 7,8} ou alimentando preferências de copépodes). No entanto, o processo físico de digestão dificulta as análises de conteúdo visual do intestino e perde geralmente suave rapina encorpado-organismos⁹. Para a alimentação de espécies por ingestão de líquidos ou para alguns consumidores invertebrados que fragmentá intensamente sua comida antes de ingestão, como anfípodas, identificação visual das espécies de presas no conteúdo do intestino é impossível¹⁰. Devido a essas limitações, a análise molecular fornece uma alternativa promissora.

Análises moleculares tornaram-se uma ferramenta comum permitindo a deteção de presa rápida e precisa no conteúdo do intestino. A variedade de tais técnicas é diversa: estratégias baseadas em anticorpos monoclonais ou reacções em cadeia do polymerase (PCR) são frequentemente usadas, por causa de sua alta especificidade e sensibilidade¹¹. O desenvolvimento de novos anticorpos monoclonais é demorada e de custo, portanto, a aplicação de outras técnicas moleculares é mais útil quando os anticorpos já não existem¹¹. Outra abordagem comum é a amplificação das regiões do ácido desoxirribonucleico (DNA), como o ácido ribonucleico ribossômico (RNA) genes presentes na maioria das espécies, usando primer universal define^12,13. Ao usar essa técnica, muitas vezes não é possível identificar toda a gama de organismos presas dentro de fontes mistas de DNA¹⁴. Uma abordagem eficaz para evitar tal uma desvantagem é usar primer grupo específico define para análises de conteúdo genético do intestino. Projetado para amplificar apenas as regiões de ADN de determinados grupos-alvo e excluir todas as outras espécies^15,16, primers específicos de grupo possibilitam a identificação de organismos de rapina no nível taxonômico dos grupos especificados sem análises secundárias de tempo – e onerosos. No entanto, como todos estripá-análise de conteúdo, tais análises fornecem apenas um instantâneo do comportamento alimentar. Portanto, combinar as análises de conteúdo intestino molecular com análises de traçadores naturais-integração de tempo (por exemplo, isótopos estáveis) é considerado benéfico^1,2.

Aqui, descrevemos um método detalhado de inquéritos baseados em PCR de interações predador-presa usando conjuntos de cartilha de grupo específicas para as regiões de ADN (rDNA) ribosomal nucleares deve ser combinada com análises de isótopos estáveis do mesmo espécime. Descrevemos a detecção de DNA de rapina única grupos através de eletroforese em gel de agarose. Além disso, apresentamos uma oportunidade para ainda mais a jusante análises de produtos PCR de tais primers específicos de grupo aplicáveis sempre que uma resolução taxonômica maior do que a especificidade dos primers é necessária. Porque o único encalhado DNA (ssDNA) fragmentos de conformações terciário de forma que são determinadas pela sua sequência primária¹⁷, pequenas variações em fragmentos amplificados por tais cartilhas específicas do grupo levam a mudanças conformacionais. Tais mudanças podem ser detectadas pelas análises de polimorfismo (SSCP) único filamento conformação com géis de poliacrilamida^17,18, permitindo uma identificação mais precisa de organismos de presa (até ao nível de espécie).

Enquanto a eletroforese em gel de agarose é uma ferramenta comum e de baixo custo para visualizar os fragmentos de DNA e determinar seu comprimento aproximado¹⁹, a resolução depende da quantidade de DNA e o corante de coloração usado²⁰. Geralmente, a visualização é direta quando se trabalha com amostras de DNA puras, mas potencialmente baixas quantidades de rapina DNA no conteúdo do intestino dos consumidores pode complicar a Pontuação dos resultados de eletroforese de gel de agarose. Ainda, esse método de deteção é viável para a tela de um baixo número de espécimes de consumidor do campo para um ou alguns grupos de presas, mas complicação o artilheiro faz a seleção de um número elevado de amostras para vários táxons de presas extremamente tempo intensivo e, portanto, impraticável. Um método de deteção mais sensível é a análise automatizada de fragmentos através de eletroforese capilar, que além disso permite a determinação do comprimento exato de fragmentos²¹. Vários microssatélites com base em estudos têm mostrado que usando diferentes corantes fluorescentes como rótulos, é possível detectar e determinar diferentes fragmentos de comprimento comparável por fragmento automatizado análise^{22,23, 24}. Portanto, apresentamos também um protocolo detalhado para a deteção paralela do DNA de várias presas grupos usando PCR com rotulado primeira demão específicas do grupo de moda e deteção através de análise de fragmento automatizado com um sequenciador automático. Além disso, apresentamos os resultados de um estudo de caso, demonstrando que a detecção de DNA de presas através de análise automatizada de fragmento é uma abordagem que também permite uma quantificação relativa de presas ingeridas.

Protocol

1. coleta de macroinvertebrados do campo e preparar as amostras para análises de conteúdo genético Gut. Coleta de macroinvertebrados em cada local, resolver indivíduos da espécie de consumidores de interesse nos tubos simples e diretamente, congelá-los em nitrogênio líquido ou gelo seco para evitar afastamento do intestino e degradação do DNA. Nota: Evite armazenar as amostras em álcool, porque alguns macroinvertebrados tendem a regurgitar antes o álcool mata-los. Use somen…

Representative Results

Usamos com sucesso as etapas descritas neste protocolo para análises de dieta dentro de diferentes estudos. Nesta seção, apresentamos exemplos descrevendo a aplicabilidade das diferentes secções do protocolo. Por exemplo, para demonstrar a eficácia dos conjuntos específicos de grupo primário estabelecido pelos autores28 e o potencial de mais a jusante as análises de produtos PCR por análises SSC…

Discussion

Aqui, apresentamos um método fácil e custo-eficiente para determinação de PCR-baseados de interações predador-presa de amostras de campo através de cartilhas específicas do grupo para as regiões de rDNA, que podem ser combinadas com outras análises non-molecular dos mesmos espécimes. No entanto, existem várias etapas críticas dentro do protocolo. Em primeiro lugar, assegurando a especificidade dos primers usados é essencial. Em segundo lugar, é fundamental evitar contaminação e perda de material de conte…

Materials

liquid nitrogen	Any	NA	For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory.
1.5 ml reaction tubes – Safelock	Any	NA	For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle.
Stereomicroscope	Any	NA	Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest.
Petri dishes	Any	NA	To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope.
Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7	Bioform	B40d	This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract.
Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5	Bioform	B40b	This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens.
DNA-ExitusPlus	AppliChem	A7409,1000RF	Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations
fuzz-free paper towel	Any	NA
Lab scale	Any	NA	Precision needs to be at least 0.01 g.
Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL)	Any	NA
Safe-Lock Tubes 2.0 ml	VWR	211-2165	It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!
Safe-Lock Tubes 1.5 ml	VWR	211-2164	It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!
Sodium chloride ≥99.5%, p.a., ACS, ISO	carlroth	3957.3	For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA.
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris	carlroth	4855.2	For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer
Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL)	carlroth	8043.1	For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer
Boric acid ≥99.8 %, p.a., ACS, ISO	carlroth	6943.2	For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained.
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	carlroth	4360.1	For extraction of DNA
Proteinase K lyophil.	carlroth	7528.1	Prepare a working solution containing 10 mg/ml.
TissueLyser II	Quiagen	85300	Bead mill for homogenization of the samples.
Stainless Steel Beads, 5 mm	Quiagen	69989	For homogenization of samples.
Heating Thermoshaker	Any	NA
Vortex Mixer	Any	NA
Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE	Hitachi	NA	Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1).
Isopropanol	carlroth	6752.5
Ethanol 99.8 %, p.a.	Any	NA
Water Molecular biology grade (ddH2O)	AppliChem	A7398,1000	nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript
Unmodified Olegonucleotides	Eurofins MWG Operon	NA	Primers unlabeled
Modified olegonucleotides	Metabion International AG	NA	Primers labelled
peqGOLD Taq all inclusive	VWR Peqlab	01-1000	Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2)
Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient	Peqlab	NA	Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine.
Standard 96 Well PCR Plates	VWR Peqlab	732-2879	Used for PCR reactions.
Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes	VWR Peqlab	732-3223	Cap stripes used to close the PCR plates.
Agarose	Peqlab	35-1020	Used for gel electrophoresis.
Microwave	Any	NA
Conical flask	Any	NA
Measuring cylinder	Any	NA
Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth	Any	NA	For agarose gel electrophoresis.
Electrophoresis Power Supply PS3002	Life Technologies	NA
Ethidium bromide solution 1 %	carlroth	2218.1	Used to prepare staining bath for agarose gels.
Formamide	carlroth	6749.1	Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses.
Bromphenol blue	AppliChem	A3640.0010	Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.
Sucrose	carlroth	4621.1	Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.
100 bp-DNA-Ladder extended	carlroth	T835.1	As size standard for agarose gel electrophoresis.
UV-Documentation system	Any	NA	To visualize gel electrophoresis results.
Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1)	carlroth	A121.1	For the preparation of polyacrylamid gels.
Ammonium peroxydisulphate	carlroth	9592.2	For the preparation of polyacrylamid gels.
foldback clips (32 mm)	Any	NA	For the preparation of polyacrylamid gels.
square-shaped plastic box (21 × 6.5 × 5 cm)	Any	NA	For the preparation of polyacrylamid gels.
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	carlroth	23.67.1	For the preparation of polyacrylamid gels.
Beaker	Any	NA
RC 10 Digital chiller	VWR	462-0138	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems)	VWR	700-2361	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Notched glass plate	VWR	730-0261	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Blank glass plate	VWR	730-0260	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Spacers	VWR	730-0262	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Comb with 25 teeth	VWR	730-0294	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Shaking platform	Any	NA	For constant shaking of the staining bath.
GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.)	Biozym	850535 (50535)	For staining of polyacrylamide gels.
GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp	AB Sciex	608098	For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B.
GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp	AB Sciex	608095	For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A.
Sample Loading Solution (SLS)	AB Sciex	608082	For automated fragment analyses.
Sequenzing plate – 96 Well Polypropylene PCR Microplate	Costar	6551	For automated fragment analyses.
Plate centrifuge, PerfectSpin P	VWR Peqlab	NA	mini plate centrifuge used to spin down PCR products.
Buffer plate – 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate	Corning	9017	For automated fragment analyses.
GenomeLab Seperation buffer	AB Sciex	608012	For automated fragment analyses.
Separation Gel – LPAI	AB Sciex	608010	For automated fragment analyses.
Sequenzer – CEQ8000 Genetic Analysis System	Beckman Coulter	NA	For automated fragment analyses.
GeneMarker V1.95	Softgenetics	NA	To analyze results of automated fragment analyses.