Måling In Vivo ændringer i ekstracellulær neurotransmittere under naturligt belønne adfærd i kvindelige syriske hamstere

Summary

Dette papir beskriver brugen af faste potentiale amperometric optagelser ved hjælp af kulfiber elektroder og enzymatiske biosensor teknologi til at måle frigivelsen af dopamin og glutamat med høj tidsmæssige opløsning under naturlige givende adfærd i den kvinde hamster.

Abstract

Evnen til at måle neurotransmitter frigivelse på en hurtig tidsskala giver mønstre af neurotransmission at være knyttet til specifikke adfærd eller manipulationer; et kraftfuldt værktøj i belyse underliggende mekanismer og kredsløb. Mens teknikken med mikrodalyse har været anvendt i årtier til at måle næsten alle analysand af interesse i hjernen, er denne teknik begrænset i tidsmæssig opløsning. Alternativt, hurtig scanning cyklisk voltammetry er både tidsligt præcis og yderst følsomme; men fordi denne teknisk vanskeligt metode bygger på electroactivity af analysand af interesse, mulighed for at opdage nonelectroactive stoffer (fx, neurotransmitteren glutamat) er elimineret. Dette papir beskriver brugen af en turn-key system, der kombinerer fast potentiale amperometry og enzymatisk biosensing at måle både electroactive og nonelectroactive neurotransmittere med tidsmæssige præcision. Parring af disse to kraftfulde teknikker giver mulighed for måling af både tonic og phasic neurotransmission med relativ lethed, og giver mulighed for optagelse af flere neurotransmittere samtidigt. Formålet med dette manuskript er at demonstrere proces til måling dopamin og glutamat neurotransmission i vivo ved hjælp af et naturligt givende adfærd (dvs., seksuel adfærd) i kvindelige hamstere, med det endelige mål at vise den tekniske gennemførlighed af denne analyse for at undersøge andre adfærd og eksperimenterende paradigmer.

Introduction

Evnen til at måle neurotransmitter frigivelse i vågen opfører dyr giver forskere at knytte bestemte funktionsmåder med rumlige og tidsmæssige mønstre af neurotransmission-et kraftfuldt værktøj til at undersøge mekanismerne og kredsløb underliggende både naturlige og operant adfærd i realtid. Historisk set har været mikrodalyse ansat til at måle elektrisk reaktive og nonreactive stoffer i det ekstracellulære miljø af hjernen¹. Denne teknik bruger en kontinuerlig strøm af en vandig opløsning af lignende ionisk komposition til den ekstracellulære væske, gennem en mikrodalyse sonde består af en lille aksel med tip af en semipermeable hule fiber membran². Efter indføring af sonden neurotransmittere eller andre analysander interesse kan krydse den semipermeable membran ved passiv diffusion før opsamles med mellemrum til efterfølgende analyse af high-performance væskekromatografi (HPLC), en analytisk kemi teknik almindeligt udnyttet til at adskille, identificere og kvantificere komponenter i en heterogen blanding³.

Selv om mikrodalyse er en følsom teknik, der kan bruges til at måle næsten alle analysand af interesse, er den tidsmæssige opløsning lav, med maksimal prøveudtagning satser på rækkefølgen minutter til snese minutter^1,2. Opfindelsen af hurtig scanning cyklisk voltammetry (FSCV), en teknik, der er afhænger af redox potentiale af electroactive arter, kan belyse nær øjeblikkelige koncentrationer af analysand af interesse i den ekstracellulære væske. I korte træk (Se Robinson et al. ⁴ for en omfattende revision), en elektrode er anvendt til at hæve og sænke spændingen i en trekantet bølge mode på en hurtig tid skala⁴. Når spændingen er i det korrekte område, er sammensatte af interesse gentagne gange oxideret og reduceret. Denne oxidation og reduktion af resultaterne i en bevægelse af elektroner, der skaber en lille vekselstrøm. Skan satser finder sted på de lynhurtige skala med oxidation og reduktion af forbindelser forekommer i mikrosekunder. Ved at fratrække baggrunden nuværende lavet af sonden fra den resulterende strøm, kan man generere en spænding vs nuværende plot unikke for hvert stof. Da tidsskala af spænding svingninger er kendt, kan disse data bruges til at beregne et plot af strømmen som funktion af tiden. De relative koncentrationer af stoffet kan således bestemmes som antallet elektroner overført i hver oxidation og reduktion reaktionen er kendt⁴.

Denne kemiske specificitet og høj tidsmæssige opløsning gør FSCV en kraftfuld teknik til påvisning af skiftende kemiske koncentrationer i vivo. Men trods disse mangfoldige fordele, denne teknik kræver omfattende tekniske ekspertise og dyrt udstyr og installation. Yderligere, nonelectroactive neurotransmittere (fx, glutamat) ikke kan måles ved hjælp af denne teknik. Heldigvis, teknologiske fremskridt inden for elektrokemi⁵, samt kommercialisering af disse opfindelser, har indført en relativt enkel metode at måle ikke-electroactive neurotransmittere i vågen opfører dyr uden at kompromittere tidsmæssige præcision-en teknik kendt som enzymatisk biosensor teknologi. Denne teknik bruger enzymatisk omdannelse af nonelectroactive neurotransmitter af interesse til to substrater, hvoraf den ene er electroactive hydrogenperoxid, som er opdaget som en amperometric oxidation aktuelle genereret af en anvendt potentiale⁵ . Kommercielt tilgængelige biosensor sonder måle (Se figur 1) selektivt analysander interesse af konkurrencedygtige reduktion af endogene interferents bidrag. I tilfælde af glutamat, er bidrag af den fælles interferent ascorbinsyre (AA) konkurrencedygtige reduceret til den målte aktuelle af co lokalisering AA oxidase aktive enzymatisk overfladen af sensor, konvertere AA til ikke-electroactive dihydroascorbate og vand. Desuden udelukker en negativt ladede Nafion polymer lag findes under laget enzym endogene anioniske stoffer.

Denne samme biosensor eksperimentel opsætning kan måle electroactive neurotransmittere som i FSCV, men i stedet den beskæftiger en fast-potential optagelse⁶. I modsætning til den oscillerende spænding i FSCV i en fast-potential optagelse holdes spændingen på redox potentiale for analysanden af interesse. Selv om det er mindre kemisk selektiv end FSCV som flere neurotransmittere kan have den samme redox potentiale, i områder i hjernen der overvældende vride i retning af en neurotransmitter, opvejer turn-key arten af denne tilgang manglen på kemiske specificitet.

Evnen til at måle både electroactive og nonelectroactive neurotransmitter frigivelse i nær real-time og knytte den til specifikke adfærdsmæssige begivenheder giver mulighed for at undersøge konvergerende neurotransmitter frigivelse. Dette manuskript detaljer brugen af dette system til at afhøre både dopamin og glutamat neurotransmission reaktion på naturlige belønning i vågen opfører hamstere. Formålet med dette papir er for detaljer processen at måle denne neurotransmitter frigivelse under seksuel adfærd hos kvindelige hamstere, med mål at demonstrere dens gennemførlighed for at undersøge andre adfærd og eksperimenterende paradigmer.

Hamstere er en ideel model for brug i elektrokemiske optagelser
Historisk, har rotter og mus modeller været ansat i studiet af seksuel adfærd. Disse gnaver arter indgå i et dynamisk copulatory sekvens, der involverer mange kvindelige solicitation adfærd, der omfatter hopping, stod og øre wiggling for at lokke den mandlige at jage og i sidste ende montere den kvindelige⁷. Montering af mandlige (med eller uden vaginal penetration) varer kun et par sekunder, hvorunder kvindelige engagerer sig i sin seksuelle adfærd kropsholdning (betegnes lordosis) også kun i et par sekunder før du genoptager aktive solicitation adfærd. Dette mønster af adfærd, der består af høje niveauer af aktivitet afbrudt med korte perioder med immobilitet, er problematisk for måling neurotransmission i opfører dyr. Først, kan der være bevægelse artefakter i de amperometric optagelser, der er relateret til neurale aktivitet. For det andet er bevægelse forbundet med udgivelsen af særlige neurotransmittere i visse områder af hjernen. For eksempel, har dopamin frigivelse været koblet til bevægeapparatet aktivitet i dorsal og ventral striatum^8,9, en konstatering, der dannede grundlag for mikrodalyse målinger af dopamin efter psykostimulanser administration¹⁰. Fordi de kvinde-typiske solicitation adfærd i most gnavere indebærer høje niveauer af bevægeapparatet aktivitet, og er repræsenteret af hovedparten af en 10 minutters seksuel adfærd test, det gør det vanskeligt at tillægge de eksplicitte komponenter af seksuel adfærd, der kollektivt vare kun ændringer i neurotransmission minutter.

For at analysere de neurokemiske profil af kvindelige seksuelle adfærd, opsøgte denne øvelse en art, hvor der er minimal bevægeapparatet aktivitet ledsager seksuel adfærd. Den copulatory sekvens i syriske hamstere (Mesocricetus auratus) er ideel til neurokemiske optagelser på grund af manglende solicitation adfærd ses typisk hos rotter og mus¹¹. Som en konsekvens, vil kvindelige hamstere indtaste og vedligeholde lordosis kropsholdning for op til 9 minutter ud af 10 minutters test session¹². Med manglen på uvedkommende bevægeapparatet bevægelser af den kvindelige, i vivo kan elektrokemiske optagelser, der kan være forbundet med komponenter af seksuelle interaktioner med mandlige opnås.

Copulatory anfald i hamstere
Efter indførelsen af en mandlig stimulus dyr i test kammer, vil hannen i første omgang deltage i anogenitale undersøgelse (AI) af kvindelige før montering hendes (fig. 2A). For at den mandlige at montere, kvindelige må påtage sig en modtagelig seksuel kropsholdning kendt som lordosis, hvori hun buer ryggen og afbøjer sin hale, så at montering mand kan få penis adgang til hendes vagina. Hannen vil montere kvinde, knugede hende bagfjerdinger med begge poter (figur 2B), og begynde frådede i et forsøg på at få penis intromission (figur 2C). Hannen vil montere kvinde (uden indsættelse) samt intromit et antal gange før til sidst at opnå ejakulation. Denne sekvens af mounts og intromissions fører til sædafgang kaldes en “copulatory bout”. Mænd vil have flere copulatory anfald inden for en enkelt session.

Protocol

alle procedurer, der beskrives her blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af The University of Minnesota, og er i overensstemmelse med den vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr 13 . 1. dyr og Cannulation kirurgi Hent syriske hamstere fra en fælles animalske leverandør til ca. 55 dage med alder. Bemærk: Selv om en alder af dyr vil variere på grund af begrænsninger af forskellige eksperimentelle paradigmer,…

Representative Results

Ved hjælp af elektrokemiske og adfærdsmæssige kodning metode beskrevet ovenfor, begyndt denne lab at karakterisere både tonic og phasic udsving i både dopamin og glutamat under i vivo optagelser af seksuel adfærd. På grund af de tidsmæssigt præcise måde af denne metode, kan vi mere præcist beskrive neurotransmission under seksuel adfærd; samt tilskrive specifikke ændringer i version mønstre til tilsvarende tonic ændringer under parring anfald, og tilsvarende forbig…

Discussion

Selvom relativt ligetil, kan nogle problemer opstå når beskæftiger denne teknik. Først, sonderne stereotaxisk placering skal være præcis: i modsætning til mikrodalyse, der prøver en bredere radius af det ekstracellulære miljø omkring sonden, denne teknik kun tillader måling af en neurotransmitter, der kommer i direkte kontakt med sonden. For det andet for kulfiber-optagelse på grund af den lille bredde af fiber, brud kan opstå, og sonden skal indsættes med bevidst pleje. I tilfælde af glutamatergic biosens…

Materials

Nembutal	Oak Pharmaceuticals Inc.	76478-501-50	Pentobarbital sodium injection, USP. This lab uses 8.5mg/100g body weight, injected intraperotineally.
Loxicom analgesic	Norbrook Laboratories	6451603670	NSAID antinflammatory and analgesic used for post-operative pain control. Generic: meloxicam.
Enroflox antibiotic	Norbrook Laboratories	5552915411	Fluoroquinolone antibiotic for post-operative infection prevention. Generic: Enrofloxacin.
Beuthanasia-D	Merck Animal Health	00061047305	Pentobarbital Sodium, Phenytoin Sodium euthanasia agent.
Bone screws	Pinnacle Technologies, Inc.	8111-16	1/8" bone screw (Pkg. of 16) used to affix skull cap to skull.
Dental acrylic (Bosworth Duz-All)	Bosworth	166261C	Self curing dental acrylic is used in construction of a skull cap to affix cannula and head mount to skull.
Hardware biosensor setup	Pinnacle Technologies, Inc.	8400-K2	Pinnacle offers complete hardware kits for new users of our tethered biosensor system for rats. Kits include a commutator, preamplifier, and data conditioning and acquisition system
Base video computer package	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K1	The base computer package includes a preconfigured computer with ample hard disk storage, a high-definition monitor, a keyboard and mouse, an uninterruptible power supply, and all necessary cables.
Video EQ700 EverFocus camera  package	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K10	EQ700 night vision capable box camera with independent IR source was obtained as part of Pinnacle video computer package. Dome camera (9000-K9) and HD camera (9000-K11) options are also available.
Sirenia Acquisition software	Pinnacle Technologies, Inc.	Free–available to download from pinnaclet.com	Sirenia Acquisition provides a single platform for recording data from any Pinnacle hardware system. The software features synchronization of all data streams, user-configurable settings, data consolidation, and multiple export options. In addition, the software includes basic review and analysis modules for biosensor recordings. Sirenia delivers free ll-in-one software that is ideal for data acquisition and review.
Tethered rat in vitro calibration kit	Pinnacle Technologies, Inc.	7000-K2-T-BAS	In order to relate the current changes measured by a biosensor to actual changes in analyte concentration, it is necessary to calibrate the biosensor prior to implantation into the animal. The process also confirms the integrity and selectivity of the sensors. Calibration kit includes 20 mL jacketed beaker (#7058), 1/2" by 1/8" magnetic stir bar (#7059), right angle clamp (#7056), 2 prong single-adjustment clamp (#7055), 4-channel calibration preamplifer (#7053), and calibration holder (#7051).
Stir plate	Corning	6795-410D	Corning digital Stirrer, 5" x 7", 120 VAC used to spin magnetic stirrer in jacketed beaker during in vitro calibration of glutamate biosensors.
Water bath capable of closed loop circulation	PolyScience	8006A11B	PolyScience 8006A11B 6L Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC water bath was used with plastic tubing to heat jacketed beaker to physiological temperature.
Carbon fiber sensor with BASi rat cannulae	Pinnacle Technology, Inc.	7002-CFS	Carbon fiber electrode used for recording dopamine neurotransmission.
Ag/AgCl reference electrode	Pinnacle Technology, Inc.	7065	Necessary for carbon fiber recordings.
Glutamate biosensors	Pinnacle Technology, Inc.	7001	Enzymatic biosensor probe used for recording glutamatergic neurotransmission.
BASi guide cannulae	Pinnacle Technologies, Inc.	7030	Guide cannulae implanted into brain region of interest to guide probe.
BASi cannula plastic headpiece for rats	Pinnacle Technologies, Inc.	7011	Headmount stabilizes probe and attaches to potentiostat.