Mäta In Vivo förändringar i extracellulär signalsubstanser under naturligt belönande beteenden i kvinnliga syriska hamstrar

Summary

Detta dokument beskriver användningen av fast-potential amperometrisk inspelningar med kolfiber elektroder och enzymatisk biosensor teknik för att mäta frisättningen av dopamin och glutamat med hög temporal upplösning under naturliga givande beteende i den kvinnliga hamster.

Abstract

Förmågan att mäta neurotransmitterfrigöraren på en snabb tidsskala tillåter mönster av neurotransmission kopplas till specifika beteenden eller manipulationer; ett kraftfullt verktyg i belysa underliggande mekanismer och kretsar. Medan tekniken med mikrodialys har använts i årtionden för att mäta nästan varje analyt sevärdheter i hjärnan, är denna teknik begränsad i temporal upplösning. Alternativt, snabb scan cyklisk voltametri är både temporally precisa och extremt känslig; eftersom denna tekniskt svår metod förlitar sig på electroactivity av analyten sevärdheter, elimineras dock möjlighet att upptäcka nonelectroactive ämnen (t.ex., signalsubstansen glutamat). Detta dokument beskriver användning av en turn-key system som kombinerar fast-potential amperometry och enzymatiska biosensing att mäta både elektroaktiva och nonelectroactive signalsubstanser med tidsmässiga precision. Hopkoppling av dessa två kraftfulla tekniker möjliggör mätning av både tonic och phasic neurotransmission med relativ lätthet, och tillåter inspelning av flera signalsubstanser samtidigt. Syftet med detta manuskript är att Visa processen att mäta dopamin och glutamat neurotransmission i vivo med ett naturligt givande beteende (dvs, sexuellt beteende) i kvinnliga hamstrar, med slutmålet att visa den teknisk genomförbarhet av denna analys för att undersöka andra beteenden och experimentella paradigm.

Introduction

Förmågan att mäta neurotransmitterfrigöraren i vaken beter sig djur tillåter forskare att koppla specifika beteenden med rumsliga och tidsmässiga mönster av neurotransmission-ett kraftfullt verktyg för att undersöka mekanismer och kretsar underliggande både naturliga och operant beteenden i realtid. Mikrodialys har historiskt sett varit anställd att mäta både elektriskt reaktiva och reaktiva ämnen i den extracellulära miljön av hjärnan¹. Denna teknik använder ett kontinuerligt flöde av en vattenlösning av liknande Joniska sammansättning till den extracellulära vätskan, genom en mikrodialys sonden består av en liten axel med en spets av en semipermeable ihålig fiber membran². Efter införande av sonden, neurotransmittorer eller andra analyter kan korsa semipermeable membranet genom passiv diffusion innan samlas mellanrum för efterföljande analys av högpresterande vätskekromatografi (HPLC), en Analytisk kemi teknik som ofta används för att separera, identifiera och kvantifiera komponenter i en heterogen blandning³.

Även om mikrodialys är en känslig teknik som kan användas för att mäta valfri analyten sevärdheter, är den temporal upplösningen låg, med maximal samplingsfrekvens storleksordningen minuter till tiotals minuter^1,2. Uppfinningen av snabb scan cyklisk voltametri (FSCV), en teknik som bygger på redoxpotential elektroaktiva arter, kan belysa nära momentana koncentrationer av analyten av intresse i den extracellulära vätskan. I korthet (se Robinson et al. ⁴ för en omfattande översyn), en elektrod används för att höja och sänka spänningen i en triangulär våg mode på en snabb tid skala⁴. När spänningen är i rätt intervall, sammansatta av intresse upprepade gånger oxideras och reduceras. Denna oxidation och reduktion resulterar i en rörelse av elektroner som skapar en liten växelström. Skanna priser äga rum på under en sekund skala med oxidation och reduktion av föreningar som förekommer i mikrosekunder. Genom att subtrahera bakgrunden nuvarande skapad av sonden från den resulterande nuvarande, kan man generera en spänning vs. aktuella handlingen unik till varje förening. Eftersom tidsskalan för spänning svängningarna är känt, kan uppgifterna användas för att beräkna en tomt på nuvarande som funktion av tiden. De relativa koncentrationerna av substansen kan således bestämmas så länge som antalet elektroner överförs i varje oxidation och reduktionsreaktion kallas⁴.

Denna kemiska specificitet och hög temporal upplösning gör FSCV en kraftfull teknik för att upptäcka kemiska koncentrationer i vivoförändras. Men trots dessa grenrör fördelar kräver denna teknik omfattande teknisk kompetens och dyr utrustning och installation. Vidare kan inte nonelectroactive signalsubstanser (t.ex., glutamat) mätas med denna teknik. Lyckligtvis, tekniska framstegen i fältet i elektrokemi⁵, liksom kommersialisering av dessa uppfinningar, har infört en relativt enkel metod att mäta icke-elektroaktiva signalsubstanser i vaken beter sig djur utan att kompromissa med tidsmässiga precision-en teknik som kallas enzymatisk biosensor teknik. Denna teknik använder enzymatisk omvandling av nonelectroactive signalsubstansen sevärdheter till två substrat, varav en är elektroaktiva väteperoxid som identifieras som en amperometrisk oxidation nuvarande genereras av en tillämpad potential⁵ . Kommersiellt tillgängliga biosensor sonder mäta (se figur 1) selektivt analyter konkurrenskraftigt minska bidraget av endogena interferents. Glutamat, är bidrag till den gemensamma interferens askorbinsyra (AA) konkurrenskraftigt sänkas till den uppmätta nuvarande med samtidig lokalisera AA oxidas på sensorn, konvertera AA till icke-elektroaktiva aktiva enzymatisk yta dihydroascorbate och vatten. Dessutom utesluter ett negativt laddade Nafion polymerskikt närvarande under enzym lager endogen anjon föreningar.

Detta samma biosensor experimentella inställning kan mäta elektroaktiva signalsubstanser som i FSCV, men i stället det sysselsätter en fast-potential inspelning⁶. I motsats till den oscillerande spänning tillämpas i FSCV, i en fast-potential inspelning hålls spänningen redox potential för analyten sevärdheter. Även om det är mindre kemiskt selektiv än FSCV eftersom flera signalsubstanser kan ha samma redox potential, i hjärnområden som överväldigande skevar mot en signalsubstans, uppväger nyckelfärdiga arten av detta tillvägagångssätt avsaknaden av kemiska specificitet.

Möjligheten att mäta både elektroaktiva och nonelectroactive neurotransmitterfrigöraren i nära realtid och länka till specifika beteendemässiga händelser ger en möjlighet att undersöka konvergerande neurotransmitterfrigöraren. Detta manuskript Detaljer användningen av detta system att förhöra både dopamin och glutamat neurotransmission svar på naturlig belöning i vaken beter sig hamstrar. Syftet med denna uppsats är att beskriva processen med att mäta denna neurotransmitterfrigöraren under sexuellt beteende i kvinnliga hamstrar, med målet att påvisa dess genomförbarhet för att pröva andra beteenden och experimentella paradigm.

Hamstrar är en idealmodell för användning i elektrokemiska recordings
Råttor och möss-modeller har historiskt sett varit anställd i studien av sexuellt beteende. Dessa gnagare engagera sig i en dynamisk copulatory sekvens, som involverar många kvinnliga värvning beteenden som inkluderar hopping, rusa, och örat vickar för att locka hanen att jaga och slutligen montera den kvinnliga⁷. Montering av hanen (med eller utan vaginal penetration) varar bara några sekunder, under vilken honan bedriver sin sexuella beteende hållning (kallas Lordos) också endast för några sekunder innan återuppta aktivt värvningsförsök beteenden. Detta mönster av beteende, sammansatt av hög aktivitet varvat med korta perioder av orörlighet, är problematiskt för att mäta neurotransmission i beter sig djur. För det första kan det finnas rörelse artefakter i amperometrisk inspelningar som är orelaterade till neural aktivitet. Andra är locomotion associerade med frisättningen av vissa signalsubstanser i vissa regioner av hjärnan. Till exempel har frisättning av dopamin varit kopplad till rörelseaktivitet i rygg- och ventrala striatum^8,9, ett konstaterande som utgjorde grunden för mikrodialys mätningar av dopamin efter psykostimulantia administration¹⁰. Eftersom de kvinnliga-typiska värvning beteenden i most gnagare involverar höga nivåer av rörelseaktivitet, och representeras av huvuddelen av ett test med 10 minuters i sexuellt beteende, detta gör det svårt att tillskriva explicit komponenterna i sexuellt beteende som kollektivt senaste endast förändringar i neurotransmission minuter.

För att analysera den neurokemiska profilen av kvinnliga sexuella beteende, denna lab uppsökt en art där det finns minimal rörelseaktivitet åtföljer sexuellt beteende. Copulatory sekvensen i syriska hamstrar (Mesocricetus auratus) är idealisk för neurokemiska inspelningar på grund av värvning beteenden typiskt sett råttor och möss¹¹. Följaktligen kommer kvinnliga hamstrar ange och underhålla Lordos kroppshållning för uppemot 9 minuter ur 10 minuters test session¹². Med bristen på ovidkommande rörelseapparaten rörelser av den kvinnliga, i vivo kan elektrokemiska inspelningar som kan förknippas med komponenter av sexuella interaktioner med hanen erhållas.

Copulatory skjutningarna i hamstrar
Efter införandet av en manlig stimulans djur in i testing kammaren, kommer hanen inledningsvis delta i anogenital undersökning (AI) av honan innan montering hennes (figur 2A). För män att montera, måste honan anta en mottaglig sexuella hållning kallas Lordos, där hon bågar ryggen och avleder sin svans så att montering hanen kan få penis tillgång till hennes vagina. Hanen kommer att montera honan, knäpper fast hennes bakkvartsparter med båda tassar (figur 2B), och börja stötande i ett försök att vinna penis tillträde (figur 2C). Hanen kommer att montera kvinnligt (utan insättning) samt intromit ett antal gånger innan att så småningom uppnå utlösning. Denna sekvens av fästen och intromissioner leder till utlösning kallas en ”copulatory släng”. Män kommer att ha flera copulatory anfall inom en enda session.

Protocol

alla förfaranden beskrivs här godkändes av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av The University of Minnesota, och i enlighet med The Guide för skötsel och användning av försöksdjur 13 . 1. djur och kanylering kirurgi Hämta syriska hamstrar från en gemensam djur leverantör till cirka 55 dagar ålder. Obs: Även om ålder på djur varierar på grund av begränsningar av olika experimentella paradigm för sexuel…

Representative Results

Med hjälp av elektrokemiska och beteendemässiga kodning metoder som beskrivs ovan, har denna lab börjat att karakterisera både tonic och phasic fluktuationer i både dopamin och glutamat under i vivo inspelningar av sexuellt beteende. På grund av det temporally-exakt sättet av denna metod, kan vi mer noggrant karakterisera neurotransmission under sexuellt beteende; samt specifika förändringar i release mönster tillskriver under parning anfall, och motsvarande övergåend…

Discussion

Även om det är relativt enkelt, kan vissa problem uppstå när sysselsätter denna teknik. Första stereotaxic placeringen av sonderna måste vara exakt: till skillnad från mikrodialys som prover en större radie av den extracellulära miljön kring sonden, denna teknik endast tillåter mätning av en signalsubstans som kommer i direkt kontakt med sond. Andra när det gäller kolfiber inspelningen, på grund av små bredden av fiber, brott kan uppstå, och sonden måste införas med avsiktlig omsorg. När det gäller …

Materials

Nembutal	Oak Pharmaceuticals Inc.	76478-501-50	Pentobarbital sodium injection, USP. This lab uses 8.5mg/100g body weight, injected intraperotineally.
Loxicom analgesic	Norbrook Laboratories	6451603670	NSAID antinflammatory and analgesic used for post-operative pain control. Generic: meloxicam.
Enroflox antibiotic	Norbrook Laboratories	5552915411	Fluoroquinolone antibiotic for post-operative infection prevention. Generic: Enrofloxacin.
Beuthanasia-D	Merck Animal Health	00061047305	Pentobarbital Sodium, Phenytoin Sodium euthanasia agent.
Bone screws	Pinnacle Technologies, Inc.	8111-16	1/8" bone screw (Pkg. of 16) used to affix skull cap to skull.
Dental acrylic (Bosworth Duz-All)	Bosworth	166261C	Self curing dental acrylic is used in construction of a skull cap to affix cannula and head mount to skull.
Hardware biosensor setup	Pinnacle Technologies, Inc.	8400-K2	Pinnacle offers complete hardware kits for new users of our tethered biosensor system for rats. Kits include a commutator, preamplifier, and data conditioning and acquisition system
Base video computer package	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K1	The base computer package includes a preconfigured computer with ample hard disk storage, a high-definition monitor, a keyboard and mouse, an uninterruptible power supply, and all necessary cables.
Video EQ700 EverFocus camera  package	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K10	EQ700 night vision capable box camera with independent IR source was obtained as part of Pinnacle video computer package. Dome camera (9000-K9) and HD camera (9000-K11) options are also available.
Sirenia Acquisition software	Pinnacle Technologies, Inc.	Free–available to download from pinnaclet.com	Sirenia Acquisition provides a single platform for recording data from any Pinnacle hardware system. The software features synchronization of all data streams, user-configurable settings, data consolidation, and multiple export options. In addition, the software includes basic review and analysis modules for biosensor recordings. Sirenia delivers free ll-in-one software that is ideal for data acquisition and review.
Tethered rat in vitro calibration kit	Pinnacle Technologies, Inc.	7000-K2-T-BAS	In order to relate the current changes measured by a biosensor to actual changes in analyte concentration, it is necessary to calibrate the biosensor prior to implantation into the animal. The process also confirms the integrity and selectivity of the sensors. Calibration kit includes 20 mL jacketed beaker (#7058), 1/2" by 1/8" magnetic stir bar (#7059), right angle clamp (#7056), 2 prong single-adjustment clamp (#7055), 4-channel calibration preamplifer (#7053), and calibration holder (#7051).
Stir plate	Corning	6795-410D	Corning digital Stirrer, 5" x 7", 120 VAC used to spin magnetic stirrer in jacketed beaker during in vitro calibration of glutamate biosensors.
Water bath capable of closed loop circulation	PolyScience	8006A11B	PolyScience 8006A11B 6L Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC water bath was used with plastic tubing to heat jacketed beaker to physiological temperature.
Carbon fiber sensor with BASi rat cannulae	Pinnacle Technology, Inc.	7002-CFS	Carbon fiber electrode used for recording dopamine neurotransmission.
Ag/AgCl reference electrode	Pinnacle Technology, Inc.	7065	Necessary for carbon fiber recordings.
Glutamate biosensors	Pinnacle Technology, Inc.	7001	Enzymatic biosensor probe used for recording glutamatergic neurotransmission.
BASi guide cannulae	Pinnacle Technologies, Inc.	7030	Guide cannulae implanted into brain region of interest to guide probe.
BASi cannula plastic headpiece for rats	Pinnacle Technologies, Inc.	7011	Headmount stabilizes probe and attaches to potentiostat.