Medição In Vivo alterações em neurotransmissores extracelulares durante naturalmente recompensando comportamentos em Hamsters sírios femininos

Summary

Este documento detalha a utilização do potencial fixo amperométrico gravações usando eletrodos de fibra de carbono e tecnologia enzimática biosensor para medir a liberação de dopamina e glutamato com alta resolução temporal durante o comportamento natural de gratificante na hamster fêmea.

Abstract

A capacidade de medir a liberação de neurotransmissores em uma escala de tempo rápida permite que os padrões de neurotransmissão para ser ligado a comportamentos específicos ou manipulações; uma poderosa ferramenta na elucidação de mecanismos e circuitos subjacentes. Enquanto a técnica do microdialysis tem sido usada há décadas para medir praticamente qualquer analito de interesse no cérebro, esta técnica é limitada em resolução temporal. Alternativamente, voltametria cíclica de varredura rápida é temporalmente precisos e extremamente sensível; no entanto, porque esse método tecnicamente difícil depende do electroactivity do analito de interesse, é eliminada a possibilidade de detectar substâncias nonelectroactive (por exemplo, o glutamato neurotransmissor). Este documento detalha o uso de um sistema turn-key que combina potencial fixo amperometry e biosensing enzimático para medir os neurotransmissores tanto eletroativos e nonelectroactive com precisão temporal. O emparelhamento destas duas poderosas técnicas permite a medição de tônico e neurotransmissão fásicos com relativa facilidade e permite a gravação de vários neurotransmissores simultaneamente. O objetivo deste manuscrito é demonstrar o processo de medição de dopamina e glutamato neurotransmissão no vivo usando um comportamento naturalmente gratificante (ou seja, comportamento sexual) em hamsters femininos, com o objetivo de exibir a viabilidade técnica deste teste para examinar outros comportamentos e paradigmas experimentais.

Introduction

A capacidade de medir a liberação de neurotransmissores em animais comportamento acordados permite que os pesquisadores de vincular comportamentos específicos com padrões espaciais e temporais da neurotransmissão-uma poderosa ferramenta para investigar os mecanismos e circuitos subjacentes a ambos naturais e comportamentos operante em tempo real. Historicamente, o microdialysis tem sido empregado para medir substâncias eletricamente reativas e não reactivas no meio extracelular do cérebro¹. Esta técnica usa um fluxo contínuo de uma solução aquosa de composição iônica semelhante ao fluido extracelular, através de uma sonda de microdialysis compo....

Protocol

todos os procedimentos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da The University of Minnesota e estão em conformidade com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório ¹³ .

1. animais e canulação cirurgia

1. obter Syrian hamster de um fornecedor de animais comuns com aproximadamente 55 dias de idade.
   Nota: Embora a idade dos animais variam devido às limitações de vários paradigmas experimentais, para o comportamento sexual é importante obter animais sexualmente maduros que são todos aproximadamente a mesma idade.
2. Animais....

Results

Usando a eletroquímica e comportamental de codificação metodologia descrita acima, este laboratório começou a caracterizar ambos tônico e fásicas flutuações em dopamina e glutamato durante gravações no vivo de comportamento sexual. Devido a maneira temporalmente-precisa desta metodologia, nós pode caracterizar com mais precisão neurotransmissão durante o comportamento sexual; bem como atribuem alterações específicas nos padrões de lançamento de correspondentes alterações tônico d.......

Discussion

Embora relativamente simples, alguns problemas podem surgir quando empregando esta técnica. Em primeiro lugar, o posicionamento estereotáxica das sondas deve ser preciso: ao contrário do microdialysis que as amostras de um raio mais amplo do meio extracelular em torno da sonda, esta técnica só permite a medição de um neurotransmissor que entra em contato direto com a sonda. Em segundo lugar, no caso da gravação de fibra de carbono, devido a pequena largura da fibra, pode ocorrer a ruptura, e a sonda deve ser introduzida .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nembutal	Carvalho Farmacêutico Inc.	76478-501-50 Injeção de	pentobarbital sódico, USP. Este laboratório usa 8,5 mg/100 g de peso corporal, injetados por via intrapericotinal.
Analgésico Loxicom	Laboratórios Norbrook	6451603670	antiinflamatório anti-inflamatório e analgésico anti-inflamatório (AINE) utilizado para o controle da dor pós-operatória. Genérico: meloxicam.
Antibiótico Enroflox	Laboratórios Norbrook	5552915411	Antibiótico fluoroquinolona para prevenção de infecções pós-operatórias. Genérico: Enrofloxacina.
Beutanásia-D	Merck Animal Health	00061047305	Pentobarbital Sódico, Fenitoína Agente de eutanásia sódica.
Parafusos ósseos	Pinnacle Technologies, Inc.	8111-16	Parafuso de osso de 1/8" (Pacote de 16) usado para fixar a calota craniana ao crânio.
Acrílico dental (Bosworth Duz-All)	Bosworth	166261C	O acrílico dental autopolimerizável é usado na construção de uma calota craniana para fixar a cânula e a montagem da cabeça no crânio.
Configuração do biossensor de hardware	Pinnacle Technologies, Inc.	8400-K2	A Pinnacle oferece kits de hardware completos para novos usuários de nosso sistema de biossensor cativo para ratos. Os kits incluem um comutador, pré-amplificador e sistema de condicionamento e aquisição
de dados Pacote básico de computador de vídeo	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K1	O pacote básico do computador inclui um computador pré-configurado com amplo armazenamento em disco rígido, um monitor de alta definição, um teclado e mouse, uma fonte de alimentação ininterrupta e todos os cabos necessários.
Vídeo EQ700 EverFocus pacote de câmera	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K10	A câmera de caixa com capacidade de visão noturna EQ700 com fonte IR independente foi obtida como parte do pacote de computador de vídeo Pinnacle. Opções de câmera dome (9000-K9) e câmera HD (9000-K11) também estão disponíveis.
Software de aquisição Sirenia	Pinnacle Technologies, Inc.	Gratuito - disponível para download em pinnaclet.com	Sirenia  A aquisição fornece uma plataforma única para registrar dados de qualquer sistema de hardware da Pinnacle. O software apresenta sincronização de todos os fluxos de dados, configurações configuráveis pelo usuário, consolidação de dados e várias opções de exportação. Além disso, o software inclui módulos básicos de revisão e análise para gravações de biossensores. Sirenia  Oferece software LL-in-One gratuito que é ideal para aquisição e revisão de dados.
Rato amarrado  in vitro  kit de calibração	Pinnacle Technologies, Inc.	7000-K2-T-BAS	Para relacionar as mudanças atuais medidas por um biossensor com as mudanças reais na concentração do analito, é necessário calibrar o biossensor antes da implantação no animal. O processo também confirma a integridade e seletividade dos sensores. O kit de calibração inclui um copo revestido de 20 mL (#7058), barra de agitação magnética de 1/2" por 1/8" (#7059), grampo de ângulo reto (#7056), grampo de ajuste único de 2 pinos (#7055), pré-amplificador de calibração de 4 canais (#7053) e suporte de calibração (#7051).
Prato de mexer	Agitador digital Corning	6795-410D	Corning, 5" x 7", 120 VAC usado para girar o agitador magnético em béquer revestido durante a calibração in vitro de biossensores de glutamato.
Banho-maria capaz de circulação em circuito fechado	PolyScience	8006A11B	PolyScience 8006A11B 6L Banho de circulação aquecido digital padrão, banho de água de 120VAC foi usado com tubulação de plástico para aquecer o béquer encamisado à temperatura fisiológica.
Sensor de fibra de carbono com cânulas de rato BASi	Pinnacle Technology, Inc.	7002-CFS	Eletrodo de fibra de carbono usado para registrar a neurotransmissão de dopamina.
Eléctrodo de referência Ag/AgCl	Pinnacle Technology, Inc.	7065	Necessário para gravações de fibra de carbono.
Biossensores de glutamato	Pinnacle Technology, Inc.	7001	Sonda biossensor enzimática usada para registrar a neurotransmissão glutamatérgica.
Cânulas guia BASi	Pinnacle Technologies, Inc.	7030	Cânulas guia implantadas na região cerebral de interesse para guiar a sonda.
Capacete de plástico para cânulas BASi para ratos	Pinnacle Technologies, Inc.	7011	O suporte de cabeça estabiliza a sonda e se conecta ao potenciostato.