Завод промоутер анализ: Определение и характеристика корень конкреций конкретной промоутера в общей бин
Summary
Промоутер выражение анализа имеют решающее значение для улучшения понимания регуляции генов и пространственно-временных выражение генов-мишеней. Здесь мы представляем протокол идентификации, изолировать и клонирования растений промоутера. Кроме того мы описывают характеристики конкреций конкретной промоутера в общие корни волосатые бин.
Abstract
Вверх по течению последовательности кодирования последовательностей гена называются в качестве промоутера последовательности. Изучая выражение закономерности промоутеров очень важны в понимании гена регулирования и моделей пространственно-временных выражение генов-мишеней. С другой стороны важно также установить промоутер оценки инструментов и методов генетической трансформации, которые являются быстрый, эффективный и воспроизводимость. В этом исследовании мы исследовали пространственно-временных выражению ризобиальной симбиоз конкретных конкреций начала (НИН) промоутер Phaseolus vulgaris трансгенных волосатые корни. Использование баз данных генома растений и инструменты анализа, мы определили, изолированные и клонированных P. vulgaris Нин промоутер в transcriptional fusion журналисту химерных β-глюкуронидазы (GUS) гусь enhanced::GFP. Кроме того этот протокол описывает быстрое и универсальная система генетической трансформации в P. vulgaris , используя Agrobacterium rhizogenes индуцированных волосатые корни. Эта система создает ≥2 см волосатые корни на 10-12 дней после преобразования. Далее мы оценивали пространственно-временных выражение Нин промоутер в волосатые корни Rhizobium прививку периодическими интервалами после прививки. Наши результаты, изображенные на активность GUS показывают, что промоутер Нин был активен в процессе узелки. Вместе настоящий Протокол показано, как определить, изолировать, клонировать и характеризуют завод промоутер в общие корни волосатые бин. Кроме того этот протокол является простой в использовании в неспециализированных лабораториях.
Introduction
Промоутеров являются важными молекулярных биологических инструментами, которые играют решающую роль в понимании регуляции экспрессии генов интерес. Учредителями являются последовательностей ДНК, расположенных вверх по течению перевода последовательностей инициации кодон гена и они несут Центральной нормативная информация генов; Таким образом их правильные аннотации и характеристика имеют жизненно важное значение для понимания функции гена. В зависимости от выражения шаблоны завод промоутеров, классифицируются как учредительный, ткане-, или развития этап конкретных и индуцибельной1. Достижения в области транскриптомики технологий, улучшение компьютерного моделирования и наличие все большего числа последовательности генома для различных видов растений способствовали крупномасштабных предсказание промоутер последовательности2.
С другой стороны важно также установить промоутер оценки инструментов и методов генетической трансформации, которые являются быстрый, эффективный и воспроизводимость. В отличие от других растений, модель функциональные характеристики общих генов бин бобовых (P. vulgaris) препятствует главным образом благодаря непокорных характер sp. фасоль для стабильной генетической трансформации. Переходных преобразований системы служат в качестве альтернативы для быстрого гена функциональная характеристика исследования3. В бобовых симбиоза научные исследования взаимодействие между бобовых растения-хозяина и ризобиальной бактерия является одним из самых шансов справиться с возникающими модель систем для функционального анализа конкреций специфичных генов и промоутер исследований. До настоящего времени, были несколько бобовых промоутеров, связанные с этим симбиозов характеризуется, viz., PT4 Люцерна truncatula 4, SWEET115, Lotus japonicus Циклоп, UBQ6, VAG17, глицин макс PT5 8, Exo70J9, P. vulgaris RbohB10,11,12, TRE113, PI3K14, TOR15, и т.д. СНГ элементы непосредственно влияют на регулирование ген. Фактор транскрипции ENBP1A связывается с регулирования региона СНГ (−692 bp) ранних nodulin VfENOD12, и это облегчает экспрессии гена репортера в конкреций Примордия Vicia Фаба16. Замена регулирования регионов СНГ (−161 для −48 bp) конкреций конкретной промоутера Легоглобин GLB3 с гетерологичных усечено промоутеров δ-p35S и δ-pNOS, привели к потере специфики конкреций и снижение активности промоутер17 .
Предыдущие доклады показывают, что фактор транскрипции Нин требуется для начала ризобиальной инфекции в клетках корневого волоска и необходимы также для органогенеза конкреций в japonicus л18. В настоящем исследовании мы описываем протокол для идентификации, изоляции, клонирование и характеристика конкреций конкретной промоутера в общие корни волосатые бин. Для достижения этой цели, мы выбрали ризобиальной промоутер Нин симбиоз конкретных P. vulgaris и клонирования в transcriptional fusion журналисту химерных гусь enhanced::GFP. Кроме того этот протокол описывает быстрое и универсальная система генетической трансформации в P. vulgaris , используя A. rhizogenes индуцированных волосатые корни. Эта система генерирует волосатые корни в менее чем за 2 недели после преобразования. Наконец мы оценивали пространственно-временных выражение Нин промоутер в rhizobia колонизировали корневого узелки, ГСУ окрашивание.
Процедура, описанная здесь может быть полезным не только для изучения11 узелки и микоризации бобовых растений, но и для изучения промоутер выражений шаблонов в корни19. Кроме того этот протокол является простой в использовании в неспециализированных лабораториях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Во время функционального анализа генов исследование картин выражения гена играет решающую роль в понимании пространственных и временных регуляции генов в естественных условиях. Хорошо известный метод для изучения картин выражения гена является клонирование гена промоутер обла…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа частично была поддержана дель Dirección General de по личной истории, DGAPA/PAPIIT-НАУ (Грант нет. IN219916 Мирча и IA205117 для М-K. A) и y Consejo Nacional de наук Tecnològia (КОНАСИТ Грант № 240614 м.л.).
Materials
| Primers for qRT-PCR assay | |||
| pNIN Forward | CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT | ||
| pNIN Reverse | CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C | ||
| M13 Forward | GTA AAA CGA CGG CCA G | ||
| M13 Reverse | CAG GAA ACA GCT ATG AC | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K243520 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme Mix | Invitrogen | 11791100 | |
| pBGWFS7.0 | Plant systems biology | https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/ | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966018 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | ThermoFisher Scientific | K210012 | |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
| Certified Molecular Biology Agarose | Bio-Rad | 1613102 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| Nacl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293-250G | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-250G | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306-1KG | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615-25G | |
| Spectinomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1441 | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Bacteriological peptone | Sigma-Aldrich | P0556 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Nalidixic acid | Sigma-Aldrich | N8878 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Gel loading solution | Sigma-Aldrich | G7654 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT | |||
| Thermocycler | Veriti Thermal Cycler | 4375786 | |
| Centrifuge | Sigma | Sigma 1-14K | |
| Gel documentation unit | Carestream | Gel Logic 212 PRO | |
| MaxQ SHKE6000 6000 Shaking Incubator – 115VAC | Thermo scientific | EW-51708-70 | |
| Plant growth chamber | MRC | PGI-550RH | |
| Horizantal laminarair flow cabinate | Lumistell | LH-120 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM4500 B | |
| Petridish | sym laboratorios | 90X15 | |
| Scalpel Blade | Fisher scientific | 53223 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| 22 mL glass tubes | Thomas scientific | 45048-16150 |
Referências
- Hernández-Garcia, C. M., Finer, J. J. Identification and validation of promoters and cis-actingregulatory elements. Plant Science. 217-218, 109-119 (2014).
- Dhanapal, A. P., Govindaraj, M. Unlimited Thirst for Genome Sequencing, Data Interpretation, and Database Usage in Genomic Era: The Road towards Fast-Track Crop Plant Improvement. Genetics Research International. , 684321 (2015).
- Nanjareddy, N., Arthikala, M. K., Blanco, L., Arellano, E. S., Lara, M. Protoplast isolation, transient transformation of leaf mesophyll protoplasts and improved Agrobacterium-mediated leaf disc infiltration of Phaseolus vulgaris: Tools for rapid gene expression analysis. BMC Biotechnol. 16 (1), 53 (2016).
- Pumplin, N., Zhang, X., Noar, R. D., Harrison, M. J. Polar localization of a symbiosis-specific phosphate transporter is mediated by a transient reorientation of secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (11), E665-E672 (2012).
- Kryvoruchko, I. S., et al. MtSWEET11, a Nodule-Specific Sucrose Transporter of Medicago truncatula. Plant Physiol. 171 (1), 554-565 (2016).
- Suzaki, T., Yano, K., Ito, M., Umehara, Y., Suganuma, N., Kawaguchi, M. Positive and negative regulation of cortical cell division during root nodule development in Lotus japonicus is accompanied by auxin response. Development. 139 (21), 3997-4006 (2012).
- Suzaki, T., et al. Endoreduplication-mediated initiation of symbiotic organ development in Lotus japonicus. Development. 141 (12), 2441-2445 (2014).
- Qin, L., et al. The high-affinity phosphate transporter GmPT5 regulates phosphate transport to nodules and nodulation in soybean. Plant Physiol. 159 (4), 1634-1643 (2012).
- Wang, Z., Panfeng, L., Yan, Y., Chi, Y., Fan, B., Chen, Z. Expression and Functional Analysis of a Novel Group of Legume-specific WRKY and Exo70 Protein Variants from Soybean. Sci Rep. 6, 32090 (2016).
- Montiel, J., et al. A Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene is required for root infection by Rhizobia. Plant Cell Physiol. 53 (10), 1751-1767 (2012).
- Arthikala, M. K., et al. PvRbohB negatively regulates Rhizophagus irregularis colonization in Phaseolus vulgaris. Plant Cell Physiol. 54 (8), 1391-1402 (2013).
- Arthikala, M. K., Sánchez-López, R., Nava, N., Santana, O., Cárdenas, L., Quinto, C. RbohB a Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene, enhances symbiosome number, bacteroid size, and nitrogen fixation in nodules and impairs mycorrhizal colonization. New Phytol. 202 (3), 886-900 (2014).
- Barraza, A., et al. Down-regulation of PvTRE1 enhances nodule biomass and bacteroid number in the common bean. New Phytol. 197 (1), 194-206 (2013).
- Estrada-Navarrete, G., et al. An autophagy-related kinase is essential for the symbiotic relationship between Phaseolus vulgaris and both rhizobia and arbuscular mycorrhizal fungi. Plant Cell. 28 (9), 2326-2341 (2016).
- Nanjareddy, K., et al. A Legume TOR Protein Kinase Regulates Rhizobium Symbiosis and Is Essential for Infection and Nodule Development. Plant Physiol. 172 (3), 2002-2020 (2016).
- Frühling, M., Schröder, G., Hohnjec, N., Pühler, A., Perlick, A. M., Küster, H. The promoter of the Vicia faba L. gene VfEnod12 encoding an early nodulin is active in cortical cells and nodule primordia of transgenic hairy roots of Vicia hirsuta as well as in the prefixing zone II of mature transgenic V. hirsuta root nodules. Plant Science. 160 (1), 67-75 (2000).
- Szabados, L., Ratet, P., Grunenberg, B., de Bruijn, F. J. Functional analysis of the Sesbania rostrata leghemoglobin glb3 gene 5′-upstream region in transgenic Lotus corniculatus and Nicotiana tabacum plants. Plant Cell Online. 2 (10), 973-986 (1990).
- Madsen, L. H., Tirichine, L., Jurkiewicz, A., Sullivan, J. T., Heckmann, A. B., Bek, A. S., Ronson, C. W., James, E. K., Stougaard, J. The molecular network governing nodule organogenesis and infection in the model legume Lotus japonicus. Nat Commun. 12, 1-10 (2010).
- Montiel, J., Arthikala, M. K., Quinto, C. Phaseolus vulgaris RbohB functions in lateral root development. Plant Signal Behav. 8 (1), 1-3 (2013).
- Nanjareddy, K., Arthikala, M. K., Gómez, B. M., Blanco, L., Lara, M. Differentially expressed genes in mycorrhized and nodulated roots of common bean are associated with defense, cell wall architecture, N metabolism, and P metabolism. PLoS ONE. 12 (8), e0182328 (2017).
- Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. Gateway vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).
- Broughton, W. J., Dilworth, M. J. Control of leghemoglobin synthesis in snake beans. Biochem J. 125 (4), 1075-1080 (1971).
- Jefferson, R. A. Assaying chimeric genes in plants, the GUS gene fusion system. Plant Mol Biol Rep. 5 (4), 387-405 (1987).
- Cho, H. J., Farrand, S. K., Noel, G. R., Widholm, J. M. High-efficiency induction of soybean hairy roots and propagation of the soybean cyst nematode. Planta. 210 (2), 195-204 (2000).
- Deng, Y., Mao, G., Stutz, W., Yu, O. Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays. J. Vis. Exp. (49), e2633 (2011).
- Kumagai, H., Kouchi, H. Gene silencing by expression of hairpin RNA in Lotus japonicus roots and root nodules. Mol Plant Microbe Interact. 16 (8), 663-668 (2003).
- Okamoto, S., Yoro, E., Suzaki, T., Kawaguchi, M. Hairy Root Transformation in Lotus japonicus. Bio-protocol. 3 (12), e795 (2013).
- Jacobs, T. B., Martin, G. B. High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots. J. Vis. Exp. (110), e53843 (2016).
- Estrada-Navarrete, G., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformation of the Phaseolus spp.: a tool for functional genomics. Mol Plant Microbe Interact. 19 (12), 1385-1393 (2006).
