De analyse van de promotor van de plant: Identificatie en karakterisering van Root knobbeltje specifieke promotor in de gemeenschappelijke Boon
Summary
Promotor expressie analyses zijn cruciaal voor de verbetering van het begrip van genexpressie en de spatio uitdrukking van de doelgenen. Hierin presenteren wij een protocol om te identificeren, isoleren en klonen van een plant promotor. Verder, beschrijven we de karakterisatie van de knobbel-specifieke promotor in de gemeenschappelijke bean harige wortels.
Abstract
De upstream sequenties van een gen dat codeert sequenties worden genoemd als promotor sequenties. Bestuderen van de expressiepatronen van de initiatiefnemers zijn zeer belangrijk in het begrijpen van de genexpressie en de spatio-expressiepatronen van doelgenen. Aan de andere kant, is het ook kritisch promotor evaluatie-instrumenten en genetische transformatie technieken die snelle, efficiënte en reproduceerbare zijn vast te stellen. In deze studie onderzochten we de spatio-expressiepatroon van de promotor van de rhizobiale symbiose-specifieke knobbeltje-oprichting (NIN) van Phaseolus vulgaris in de transgene harige wortels. Met behulp van plant genoom databases en analysetools we geïdentificeerd, geïsoleerd, en de promotor P. vulgaris NIN in een transcriptionele fusie aan de chimeer verslaggever gekloond β-glucuronidase (GUS) GUS-enhanced::GFP. Dit protocol beschrijft verder een snelle en veelzijdige systeem van genetische transformatie in de P. vulgaris met Agrobacterium rhizogenes geïnduceerde harige wortels. Dit systeem genereert ≥2 cm harige wortels op 10 tot 12 dagen na de transformatie. Vervolgens beoordeeld wij de spatio uitdrukking van NIN promotor in Rhizobium geïnoculeerd harige wortels van na inoculatie met regelmatige tussenpozen. Onze resultaten afgebeeld door GUS activiteit tonen aan dat de promotor NIN actief tijdens het proces van nodulatie was. Samen, het huidige protocol laat zien hoe identificeren, isoleren, klonen en karakteriseren van de promotor van een plant in de gemeenschappelijke bean harige wortels. Dit protocol is bovendien makkelijk te gebruiken in niet-gespecialiseerde laboratoria.
Introduction
Initiatiefnemers zijn belangrijke moleculaire biologische instrumenten een cruciale rol spelen in het begrijpen van de regulering van de expressie van genen van belang. Initiatiefnemers zijn opeenvolgingen van DNA, stroomopwaarts gelegen van de vertaling initiatie codon van gen-sequenties en zij dragen de centrale wettelijk verplichte informatie van genen; Daarom zijn hun juiste annotatie en karakterisering van vitaal belang voor het begrip van de genfunctie. Afhankelijk van de expressiepatronen, worden de initiatiefnemers van de plant geclassificeerd als constitutief, weefsel-specifiek, of ontwikkeling-fase-specifieke en afleidbare1. Voorschotten in transcriptomic technologieën, verbeteringen in computer modeling en de beschikbaarheid van het toenemend aantal genoom sequenties voor verschillende plantensoorten hebben vergemakkelijkt de grootschalige voorspelling van promotor sequenties2.
Aan de andere kant, is het ook kritisch promotor evaluatie-instrumenten en genetische transformatie technieken die snelle, efficiënte en reproduceerbare zijn vast te stellen. In tegenstelling tot de andere model planten, wordt de functionele karakterisering van gemeenschappelijke bean peulvruchten (P. vulgaris) genen belemmerd voornamelijk vanwege de recalcitrante aard van Phaseolus sp. voor stabiele genetische transformatie. Voorbijgaande transformatie systemen dienen als alternatief voor snelle gene functionele karakterisering studies3. De interactie tussen de peulvrucht waardplant en rhizobiale bacterie is in peulvruchten symbiose onderzoek, een van de meest hanteerbare modelsystemen voor de functionele analyse van knobbeltje-specifieke genen en promotor studies. Tot nu toe verschillende peulvrucht initiatiefnemers aan deze symbiose gerelateerde geweest gekenmerkt, namelijk, Medicago truncatula PT44, SWEET115, Lotus japonicus Cyclops, UBQ6, VAG17, Glycine max PT5 8, Exo70J9, P. vulgaris RbohB10,11,12, TRE113, PI3K14, TOR15, enz. CIS genregulatie rechtstreeks van invloed zijn elementen. De transcriptiefactor ENBP1A bindt aan een Cis regelgevende regio (−692 bp) van vroege nodulin VfENOD12, en dit vergemakkelijkt de expressie van een verslaggever gen in knobbeltje primordia Vicia faba16. Vervanging van Cis regelgevende regio’s (−161 met −48 bp) van de promoter knobbeltje-specifieke leghemoglobin GLB3 met het heterologe afgekapt initiatiefnemers δ-p35S en δ-pNOS, resulteerde in een verlies van knobbeltje specificiteit en verminderd promotor activiteit17 .
Eerdere verslagen tonen aan dat de transcriptiefactor NIN is vereist voor de opening van rhizobiale infectie in de haarcellen van wortel en is eveneens essentieel voor knobbel organogenese van L. japonicus18. In de huidige studie beschrijven we een protocol voor identificatie, isolatie, klonen en karakterisering van knobbeltje-specifieke promotor in de gemeenschappelijke bean harige wortels. Om dit te bereiken, we een rhizobiale symbiose-specifieke NIN promotor van P. vulgaris geselecteerd en gekloond in een transcriptionele fusie aan de chimeer verslaggever GUS-enhanced::GFP. Dit protocol beschrijft verder een snelle en veelzijdige systeem van genetische transformatie in de P. vulgaris met behulp van A. rhizogenes geïnduceerde harige wortels. Dit systeem produceert harige wortels in minder dan 2 weken na de transformatie. Tot slot, wij beoordeeld de spatio uitdrukking van NIN promotor in de knobbeltjes van de wortel van Rhizobium gekoloniseerd door GUS kleuring.
De hier beschreven procedure wellicht nuttig niet alleen voor de studie van nodulatie en mycorrhization11 van peulvruchten planten, maar ook voor de studie van de promotor-expressiepatronen in wortels19. Dit protocol is bovendien makkelijk te gebruiken in niet-gespecialiseerde laboratoria.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tijdens de functionele analyse van genen speelt de studie van gen-expressiepatronen een cruciale rol in het begrijpen van de ruimtelijke en temporele regulering van de genen in vivo. Een bekende methode om te studeren van gen-expressiepatronen is te klonen van het gen promotor regio van belang, stroomopwaarts aan verslaggever genen zoals fluorescerende markers (GFP, RFP, enz.) of β-glucuronidase. Wij hebben hierin een regio van de promotor van de wortel knobbeltje symbiose (RNS) specifiek gen, NIN, te …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd slechts gedeeltelijk ondersteund door de Dirección General de Asuntos del persoonlijke Académico, DGAPA/PAPIIT-UNAM (verlenen neen. IN219916 M.L en IA205117 aan M-K. A) en de Consejo Nacional de Ciencia y Tecnològia (CONACYT subsidie no. 240614 voor de M.L.).
Materials
| Primers for qRT-PCR assay | |||
| pNIN Forward | CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT | ||
| pNIN Reverse | CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C | ||
| M13 Forward | GTA AAA CGA CGG CCA G | ||
| M13 Reverse | CAG GAA ACA GCT ATG AC | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K243520 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme Mix | Invitrogen | 11791100 | |
| pBGWFS7.0 | Plant systems biology | https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/ | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966018 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | ThermoFisher Scientific | K210012 | |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
| Certified Molecular Biology Agarose | Bio-Rad | 1613102 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| Nacl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293-250G | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-250G | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306-1KG | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615-25G | |
| Spectinomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1441 | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Bacteriological peptone | Sigma-Aldrich | P0556 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Nalidixic acid | Sigma-Aldrich | N8878 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Gel loading solution | Sigma-Aldrich | G7654 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT | |||
| Thermocycler | Veriti Thermal Cycler | 4375786 | |
| Centrifuge | Sigma | Sigma 1-14K | |
| Gel documentation unit | Carestream | Gel Logic 212 PRO | |
| MaxQ SHKE6000 6000 Shaking Incubator – 115VAC | Thermo scientific | EW-51708-70 | |
| Plant growth chamber | MRC | PGI-550RH | |
| Horizantal laminarair flow cabinate | Lumistell | LH-120 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM4500 B | |
| Petridish | sym laboratorios | 90X15 | |
| Scalpel Blade | Fisher scientific | 53223 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| 22 mL glass tubes | Thomas scientific | 45048-16150 |
Referências
- Hernández-Garcia, C. M., Finer, J. J. Identification and validation of promoters and cis-actingregulatory elements. Plant Science. 217-218, 109-119 (2014).
- Dhanapal, A. P., Govindaraj, M. Unlimited Thirst for Genome Sequencing, Data Interpretation, and Database Usage in Genomic Era: The Road towards Fast-Track Crop Plant Improvement. Genetics Research International. , 684321 (2015).
- Nanjareddy, N., Arthikala, M. K., Blanco, L., Arellano, E. S., Lara, M. Protoplast isolation, transient transformation of leaf mesophyll protoplasts and improved Agrobacterium-mediated leaf disc infiltration of Phaseolus vulgaris: Tools for rapid gene expression analysis. BMC Biotechnol. 16 (1), 53 (2016).
- Pumplin, N., Zhang, X., Noar, R. D., Harrison, M. J. Polar localization of a symbiosis-specific phosphate transporter is mediated by a transient reorientation of secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (11), E665-E672 (2012).
- Kryvoruchko, I. S., et al. MtSWEET11, a Nodule-Specific Sucrose Transporter of Medicago truncatula. Plant Physiol. 171 (1), 554-565 (2016).
- Suzaki, T., Yano, K., Ito, M., Umehara, Y., Suganuma, N., Kawaguchi, M. Positive and negative regulation of cortical cell division during root nodule development in Lotus japonicus is accompanied by auxin response. Development. 139 (21), 3997-4006 (2012).
- Suzaki, T., et al. Endoreduplication-mediated initiation of symbiotic organ development in Lotus japonicus. Development. 141 (12), 2441-2445 (2014).
- Qin, L., et al. The high-affinity phosphate transporter GmPT5 regulates phosphate transport to nodules and nodulation in soybean. Plant Physiol. 159 (4), 1634-1643 (2012).
- Wang, Z., Panfeng, L., Yan, Y., Chi, Y., Fan, B., Chen, Z. Expression and Functional Analysis of a Novel Group of Legume-specific WRKY and Exo70 Protein Variants from Soybean. Sci Rep. 6, 32090 (2016).
- Montiel, J., et al. A Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene is required for root infection by Rhizobia. Plant Cell Physiol. 53 (10), 1751-1767 (2012).
- Arthikala, M. K., et al. PvRbohB negatively regulates Rhizophagus irregularis colonization in Phaseolus vulgaris. Plant Cell Physiol. 54 (8), 1391-1402 (2013).
- Arthikala, M. K., Sánchez-López, R., Nava, N., Santana, O., Cárdenas, L., Quinto, C. RbohB a Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene, enhances symbiosome number, bacteroid size, and nitrogen fixation in nodules and impairs mycorrhizal colonization. New Phytol. 202 (3), 886-900 (2014).
- Barraza, A., et al. Down-regulation of PvTRE1 enhances nodule biomass and bacteroid number in the common bean. New Phytol. 197 (1), 194-206 (2013).
- Estrada-Navarrete, G., et al. An autophagy-related kinase is essential for the symbiotic relationship between Phaseolus vulgaris and both rhizobia and arbuscular mycorrhizal fungi. Plant Cell. 28 (9), 2326-2341 (2016).
- Nanjareddy, K., et al. A Legume TOR Protein Kinase Regulates Rhizobium Symbiosis and Is Essential for Infection and Nodule Development. Plant Physiol. 172 (3), 2002-2020 (2016).
- Frühling, M., Schröder, G., Hohnjec, N., Pühler, A., Perlick, A. M., Küster, H. The promoter of the Vicia faba L. gene VfEnod12 encoding an early nodulin is active in cortical cells and nodule primordia of transgenic hairy roots of Vicia hirsuta as well as in the prefixing zone II of mature transgenic V. hirsuta root nodules. Plant Science. 160 (1), 67-75 (2000).
- Szabados, L., Ratet, P., Grunenberg, B., de Bruijn, F. J. Functional analysis of the Sesbania rostrata leghemoglobin glb3 gene 5′-upstream region in transgenic Lotus corniculatus and Nicotiana tabacum plants. Plant Cell Online. 2 (10), 973-986 (1990).
- Madsen, L. H., Tirichine, L., Jurkiewicz, A., Sullivan, J. T., Heckmann, A. B., Bek, A. S., Ronson, C. W., James, E. K., Stougaard, J. The molecular network governing nodule organogenesis and infection in the model legume Lotus japonicus. Nat Commun. 12, 1-10 (2010).
- Montiel, J., Arthikala, M. K., Quinto, C. Phaseolus vulgaris RbohB functions in lateral root development. Plant Signal Behav. 8 (1), 1-3 (2013).
- Nanjareddy, K., Arthikala, M. K., Gómez, B. M., Blanco, L., Lara, M. Differentially expressed genes in mycorrhized and nodulated roots of common bean are associated with defense, cell wall architecture, N metabolism, and P metabolism. PLoS ONE. 12 (8), e0182328 (2017).
- Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. Gateway vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).
- Broughton, W. J., Dilworth, M. J. Control of leghemoglobin synthesis in snake beans. Biochem J. 125 (4), 1075-1080 (1971).
- Jefferson, R. A. Assaying chimeric genes in plants, the GUS gene fusion system. Plant Mol Biol Rep. 5 (4), 387-405 (1987).
- Cho, H. J., Farrand, S. K., Noel, G. R., Widholm, J. M. High-efficiency induction of soybean hairy roots and propagation of the soybean cyst nematode. Planta. 210 (2), 195-204 (2000).
- Deng, Y., Mao, G., Stutz, W., Yu, O. Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays. J. Vis. Exp. (49), e2633 (2011).
- Kumagai, H., Kouchi, H. Gene silencing by expression of hairpin RNA in Lotus japonicus roots and root nodules. Mol Plant Microbe Interact. 16 (8), 663-668 (2003).
- Okamoto, S., Yoro, E., Suzaki, T., Kawaguchi, M. Hairy Root Transformation in Lotus japonicus. Bio-protocol. 3 (12), e795 (2013).
- Jacobs, T. B., Martin, G. B. High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots. J. Vis. Exp. (110), e53843 (2016).
- Estrada-Navarrete, G., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformation of the Phaseolus spp.: a tool for functional genomics. Mol Plant Microbe Interact. 19 (12), 1385-1393 (2006).
