Интеграция свободной деривации индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток с использованием матрицы Laminin 521
Summary
Надежный вывод клеток, индуцированных человеком, с плюрипотентными стволовыми клетками (hiPS), был достигнут за счет использования неинтегрирующего вектора передачи вируса Сендай (SeV), опосредованного перепрограммированием дермальных фибробластов. Поддержание клеток hiPS и расширение клона было выполнено с использованием безсеносных и химически определенных условий культивирования с рекомбинантной матрицей ламинана человека 521 (LN-521) и средой Essential E8 (E8).
Abstract
Ксено-свободные и полностью определенные условия являются ключевыми параметрами для надежной и воспроизводимой генерации однородных человеческих клеток с плюрипотентными стволовыми клетками (hiPS). Обслуживание клеток hiPS на фидерных клетках или неопределенных матрицах восприимчиво к периодическим отклонениям, патогенному загрязнению и риску иммуногенности. Использование определенной рекомбинантной матрицы человеческого laminin 521 (LN-521) в сочетании с безсеноновыми и определенными рецептурами среды снижает вариабельность и позволяет обеспечить последовательную генерацию клеток hiPS. Вектор вируса Сендай (SeV) представляет собой неинтегрирующую систему на основе РНК, поэтому можно обойти проблемы, связанные с потенциальным разрушительным эффектом на интеграционные векторы целостности генома. Кроме того, эти векторы продемонстрировали относительно высокую эффективность в перепрограммировании дермальных фибробластов. Кроме того, ферментативный односегментный пассаж клеток облегчает гомогенное поддержание клеток hiPS без существенного предшествующего опыта стволовых клетокКультуру. Здесь мы описываем протокол, который был широко протестирован и разработан с акцентом на воспроизводимость и простоту использования, обеспечивая надежный и практичный способ создания определенных и безсеносных человеческих hiPS-клеток из фибробластов.
Introduction
Поскольку первый вывод клеточных линий hiPS по Takahashi et al. 1 , 2 , hiPS-клетки предоставили полезный инструмент для моделирования болезней, обнаружения лекарств и в качестве исходного материала для создания клеточной терапии в регенеративной медицине. 3 . Культура клеток hiPS уже давно зависит от совместной культивирования с фибробластовыми фидерными клетками 4 , 5 или Matrigel 6 и со средними препаратами, содержащими фетальную бычью сыворотку (FBS). Отклонения от партии к партии являются общим следствием неопределенного характера этих условий культуры, что приводит к непредсказуемым изменениям, что является основным фактором ненадежности этих протоколов 7 . Разработка определенной среды, такой как Essential 8 (E8) 8 и определенные матрицы клеточной культуры, например LN-521 9 , позволяютS для установления высоковоспроизводимых протоколов и помощи в надежной генерации и поддержании гомогенных клеток hiPS 7 , 8 , 9 , 10 .
Развитие методов бесплатного перепрограммирования интеграции было скачком вперед. Первоначально перепрограммирование зависело от ретровирусных векторов, которые случайным образом интегрировались в геном с разрушительным воздействием на геномную целостность 11 . Достижения в методологиях перепрограммирования включают разработку векторов на основе РНК. РНК-векторы имеют преимущество перед методом репрограммирования на основе ДНК, поскольку непреднамеренная интеграция через геномную рекомбинацию невозможна 12 . SEV-векторы обеспечивают высокую и временную экспрессию экзогенных факторов посредством одноцепочечной РНК без ДНК-фазы 11 . Перепрограммирующие векторы, поставляемые SeVРазводят по всему клеточному расширению и, в конце концов, избавляются от культуры, обеспечивая свободный способ перепрограммирования. После этого поддержание плюрипотентности зависит от эндогенной экспрессии плюрипотентных генов 2 .
Поскольку новаторские методы терапии на основе hiPS начинают переходить в клинические испытания, требования к стандартизованным партиям, воспроизводимости и безопасности являются важными проблемами для решения проблемы 13 . Поэтому следует избегать продуктов животного происхождения. Например, использование ксеногенных продуктов связано с риском заражения нечеловеческим патогеном. Было показано, что клетки, культивируемые в присутствии компонентов культуры животного происхождения, включают в себя нечеловеческие силикатные кислоты в клеточные мембраны, которые угрожают сделать производные клетки иммуногенными 14 . Следовательно, необходимость устранения ксеногенных продуктов необходима для любых будущих клинических занятий. Этот протокол применяется xeБесплодная и определенная культура в поддержании клеток hiPS, перемещающих клетки ближе к клиническому соблюдению.
Этот протокол описывает последовательный, очень воспроизводимый и простой в использовании метод, который генерирует стандартизованные клетки hiPS из фибробластов. Он также предлагает удобную систему культивирования для обслуживания установленных hiPS-камер. Этот протокол был использован для получения более 300 линий клеточных линий hiPS на шведском национальном объекте iPS Core человека в Каролинском институте, из которых некоторые линии ранее были описаны 15 , 16 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Ожидаемым результатом этого протокола является успешное создание нескольких клонированных клеточных линий hiPS. Важно отметить, что способ поддержания и расширения установленных hiPS-клеток, описанный здесь, является надежным и может быть осуществлен с небольшим предварительным опытом…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана финансирующими агентами SSF (B13-0074) и VINNOVA (2016-04134).
Materials
| Dispase | Life Technologies | 171105-041 | Biopsy digestion |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Biopsy digestion |
| Gelatin | Sigma | G1393 | Fibroblast matrix |
| IMDM | Life Technologies | 21980002-032 | Fibroblast medium |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | Fibroblast medium |
| PenicillinStreptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Antibiotic |
| Essential 8 media | ThermFisher Scientific | A1517001 | iPS cell culture media |
| LN-521 | Biolamina | LN521-03 | iPS cell culture matrix |
| TrypLE select 1X | ThermoFisher Scientific | 12563011 | Dissociation reagent |
| Rho-kinase inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | Rho-kinase inhibitor (ROCKi) |
| CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit | Life Technologies | A1377801 | Sendai virus reprogramming vector |
| 35 mm tissue culture dish | Sarstedt | 83.3900.300 | Cell culture |
| 60 mm tissue culture dishes | Sarstedt | 83.3901.300 | Cell culture |
| 24 well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3922.300 | Cell culture |
| T25 tissue culture flasks | VWR | 734-2311 | Cell culture |
| 15 ml tubes | Corning | 430791 | Centrifuge tubes |
| 1.5 ml tube | Eppendorf | 0030123.301 | 1.5 ml tube |
| CoolCell cell LX | Biocision | BCS-405 | Freezing container |
| DMSO | Sigma | D2650-100ml | Fibroblast freezing |
| Cryovials 1.8 ml | VWR | 479-6847 | Cryovials |
| PSC Cryopreservation Kit | Gibco | A2644601 | PSC CryomediumRevitaCell supplement |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | ThermoFisherScientific | 25300054 | Fibroblast dissociation enzyme |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 31331-028 | Digestive enzymes dilutant |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | PBS |
| HBSS | ThermoFIsher Scientific | 14025-050 | Biopsy preparation |
| Haemocytometer | Sigma | BRAND, 718920 | Cell counting |
Referências
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Jin, Z. B., Okamoto, S., Xiang, P., Takahashi, M. Integration-free induced pluripotent stem cells derived from retinitis pigmentosa patient for disease modeling. Stem Cells Transl Med. 1 (6), 503-509 (2012).
- Zhou, H., Ding, S. Evolution of induced pluripotent stem cell technology. Curr Opin Hematol. 17 (4), 276-280 (2010).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Hovatta, O., et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum Reprod. 18 (7), 1404-1409 (2003).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
- Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotech. 28 (6), 611-615 (2010).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Meth. 8 (5), 424-429 (2011).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nat Commun. 5, 3195 (2014).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
- Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
- Unger, C., Skottman, H., Blomberg, P., Dilber, M. S., Hovatta, O. Good manufacturing practice and clinical-grade human embryonic stem cell lines. Hum Mol Genet. 17 (R1), R48-R53 (2008).
- Martin, M. J., Muotri, A., Gage, F., Varki, A. Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nat Med. 11 (2), 228-232 (2005).
- Kele, M., et al. Generation of human iPS cell line CTL07-II from human fibroblasts, under defined and xeno-free conditions. Stem Cell Research. 17 (3), 474-478 (2016).
- Uhlin, E., et al. Derivation of human iPS cell lines from monozygotic twins in defined and xeno free conditions. Stem Cell Research. 18, 22-25 (2017).
- . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2009)
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
- Jacobs, K., et al. Higher-Density Culture in Human Embryonic Stem Cells Results in DNA Damage and Genome Instability. Stem Cell Reports. 6 (3), 330-341 (2016).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotech. 33 (1), 58-63 (2015).
- . Ideal Xeno-Free Culture Conditions For Human Fibroblasts That Facilitate Efficient Reprogramming Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/xeno-free-culture-conditions-fibroblasts-poster.pdf (2016)
- Trokovic, R., Weltner, J., Noisa, P., Raivio, T., Otonkoski, T. Combined negative effect of donor age and time in culture on the reprogramming efficiency into induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 15 (1), 254-262 (2015).
