تسجيل الكهربية من<em> ذبابة الفاكهة</em> تريتشويد سنسيلا في الاستجابة ل أودورانتس من التقلب المنخفض
Summary
الهدف العام من هذا البروتوكول هو للتدليل على كيفية تقديم الروائح من تقلبات منخفضة لتسجيل واحد سينسيلوم من ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية مستقبلات الشمية التي تستجيب لفيرومونات القشرية طويلة السلسلة.
Abstract
تعتمد الحشرات على إحساسها بالرائحة لتوجيه مجموعة واسعة من السلوكيات الحاسمة لبقائها، مثل البحث عن الطعام، وتجنب المفترس، وضع البيض، والتزاوج. وقد تم تحديد المواد الكيميائية التي لا تعد ولا تحصى من تقلبات متفاوتة كما الروائح الطبيعية التي تنشط الحشرات الخلايا العصبية مستقبلات أولفاكتوري (أورنز). ومع ذلك، فقد عرقلت دراسة ردود حاسة الشم إلى رائحة منخفضة التقلبات بسبب عدم القدرة على تقديم مثل هذه المحفزات بشكل فعال باستخدام أساليب توصيل الرائحة التقليدية. هنا، ونحن تصف الإجراء الذي يسمح العرض الفعال للالرائحة منخفضة التقلبات لفي الجسم الحي تسجيل سينسيلوم واحد (سر). من خلال تقليل المسافة بين مصدر الرائحة والأنسجة المستهدفة، يسمح هذا الأسلوب لتطبيق الرائحة بيولوجيا ولكن حتى الآن الروائح التي لا يمكن الوصول إليها، بما في ذلك حمض بالميتوليك، فرمون تحفيز مع تأثير واضح على أورنس المشاركة في السلوك التزاوج والتزاوج 1 .وبالتالي لدينا الإجراء يتيح وسيلة جديدة لفحص مجموعة من الروائح منخفضة التقلبات لدراسة الشم الحشرات والاتصالات فرمون.
Introduction
ذبابة الفاكهة تستجيب أورنس لعدد كبير من الروائح الكريهة، مع أطوال سلسلة الكربون واسعة النطاق ومجموعة متنوعة من المجموعات الوظيفية، بما في ذلك الاسترات والكحول والكيتونات والكتونات والألدهيدات والتيربين والأحماض العضوية والأمينات ومركبات الكبريت والحلقات غير المتجانسة والعطريات 2 ، 3 – تختلف الروائح في خصائصها الفيزيائية يمكن أن يكون لها تقلبات مختلفة بشكل ملحوظ، ويشار إليها بضغط بخار المركب. والجدير بالذكر أن الروائح ذات الصلة بيولوجيا لذبابة الفاكهة ميلانوغاستر تختلف بشكل كبير في تقلباتها. على سبيل المثال، IR92a أورنس تستجيب للأمونيا 4 ، وهو متقلب للغاية، مع ضغط بخار 6،432 مم زئبق عند 20 درجة مئوية. في المقابل، OR67d أورنس الرد على فرمون الذكور، رابطة الدول المستقلة خلات -vaccenyl ( ج فا) 5 ، 6 ، ضغط البخار الذي هو 43 مم زئبق في 20 درجة مئوية.
ove_content "> إن دراسة الاستجابة الشمية لرائحة التقلب المنخفض تحديا بشكل خاص مع الطرق التقليدية لتسليم الروائح، حيث يتم تسليم الروائح عبر تيار هوائي ناقل على مسافة طويلة نسبيا ( أي عدة سنتيمترات)، وعلى هذا النحو، إلى رائحة منخفضة تقلب منخفض يمكن أن تختلف إلى حد كبير، اعتمادا على تصميم نظام تسليم الرائحة.على سبيل المثال، ورد رد فعل أورن OR67D إلى جرعة عالية من ج فا تتراوح بين ~ 40 7 -> 200 المسامير / ق 6 وعلاوة على ذلك، من المرجح عزا تسليم غير الفعال للج VA مع طرق التسليم التقليدية إلى النتائج السلبية الكاذبة، مما يؤدي إلى التفسير الذي ج VA في حد ذاته لا يكفي لتنشيط Or67d ORNs 8. وطعن هذا التفسير بعد دراسة أخرى باستخدام على مقربة من طريقة الروائح التسليم 9. ولذلك فمن إمبيرامن أجل تطوير نظام قوي لتسليم الروائح من أجل العرض الفعال للرائحة ذات التقلبات المنخفضة.في الآونة الأخيرة، حددنا العديد من سلسلة طويلة الأحماض الدهنية الدهنية كما بروابط ل أورنس أور 47b. وهي موجودة في نوع 4 أنتينال تريشويد سينسيلوم (at4). من بين سلسلة طويلة من الروائح الكريهة الأحماض الدهنية، وجدنا أن حمض بالميتوليك يعمل كفرمون مثير للشهوة الجنسية الذي يعزز محاكم الذكور عن طريق تفعيل أورنس أور 47b 1 . ومع ذلك، في دراسة أخرى باستخدام طريقة تقليدية رائحة التسليم، وأظهرت لوريت الميثيل لانتزاع ردود من أورنس أور 47b، في حين أن حمض بالميتوليك أثار أي رد عندما قدمت من نفس المسافة 10 . بالمقارنة مع C فا، الأحماض الدهنية طويلة السلسلة هي أقل تقلبا، مع ضغوط بخار أقل من 0.001 مم زئبق عند 25 درجة مئوية 11 . التذبذب المنخفض بطبيعته من الروائح الكريهة الأحماض الدهنية الطويلة السلسلة، والذي يحول دون العرض الفعال للهوائي عبرأنظمة تسليم الرائحة التقليدية، من المرجح أن تمثل نتائج سلبية كاذبة 10 . هذا التناقض يسلط الضوء على عدم كفاية أنظمة تسليم الرائحة التقليدية في تقديم الروائح منخفضة التقلب. وقد تبين سابقا أن التسليم الفعال للروائح الغليان يطير يتطلب قريبة من مصدر الرائحة والأنسجة المستهدفة 6 . وهكذا، لتوصيف كامل آثار الفيرومونات النشطة بيولوجيا في حين محاكاة المسافة التي من المحتمل أن تواجهها ذباب الفاكهة في الطبيعة 12 ، 13 ، اتفقنا على أن الحد الأدنى من المسافة يجب أن تمنح أولوية عالية في إجراءاتنا.
أسلوبنا يحمل المزيد من المزايا، بما في ذلك التوافق مع منصات الكهربية القياسية والتقنيات. تتطلب أجهزة تلاعب الحفار الموجودة مسبقا الحد الأدنى من التعديل لاستيعاب هذا البروتوكول، ومعظم خطوات سر تتطلب تعديلات طفيفة فقط. هذهيجعل تقنيتنا متاحة بسهولة للباحثين من ذوي الخبرة في سر. وعلاوة على ذلك، وتقنياتنا يسمح لعرض الروائح ذات تقلبات منخفضة مع بداية حادة والإزاحة، وربط تسليم التحفيز مع استجابة الخلايا العصبية. وأخيرا، يسهل تخطيط الأجهزة التبادلات السريعة بين خراطيش الرائحة، وتسريع جمع البيانات على مدى الجرعة المطلوبة.
نبدأ من خلال مراجعة إعداد مرجعية وتسجيل أقطاب، الكبار مثل المحلول الدملمف (أهل)، خراطيش تسليم الرائحة، و أولفاكتوميتر المقابلة. ثم نناقش إعداد حلول بالميتوليك حمض رائحة، تليها إعداد ذبابة للتسجيل. ونحن نمضي قدما في النظر في معايير اختيار سنسيلوم الخلقي لتسجيل وأكثر عن كثب تحديد المواقع من خرطوشة رائحة قبل تقديم البيانات التمثيلية المكتسبة باستخدام هذه الطريقة. وأخيرا، نختتم من خلال استكشاف التطبيقات المفيدة لهذا تكنيقإي، بعض القضايا التي واجهتها، وحلولها.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، وصفنا الإجراء الذي الردود من أورنس أور 47b إلى حمض بالميتوليك يمكن أن يسببها بقوة وتسجيلها. قمنا بتعديل التقليدية لمسافات طويلة طريقة تسليم رائحة 2 ، 7 ، 10 لاستكشاف مشكلة عدم كفاية فيرمون تسليم رائحة. تناولنا مسأل…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر يي تشانغ للمساعدة في آثار عينة و تين كي تسانغ للمساعدة في الصور. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة راي توماس إدواردز جائزة الوظيفي المبكر ومنح المعاهد الوطنية للصحة (R01DC015519) إلى C.-يس والمنح المعاهد الوطنية للصحة (R01DC009597 و R01DK092640) ل جو
Materials
| Prep Setup & Miscellaneous Materials | |||
| Pipette Puller Instrument | Sutter Instruments Novato CA USA |
P97 | Pipette Puller |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments Sarasota FL USA |
1B100F-4 | to make holding rods |
| Aluminosilicate Glass Capillaries | Sutter Instruments Novato CA USA |
AF100-64-10 | to make electrodes |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific Pittsburgh PA USA |
12-550-143 | for fly-prep station |
| Permanent Double Sided Tape | Scotch St. Paul MN USA |
NA | for fly-prep station |
| Upright microscope | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
BX51 | for recording rig |
| Plastalina modeling clay | Van Aken North Charleston SC USA |
B0019QZMQQ | for prep station and to stablize the holding rod |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm | Nalgene Rochester NY USA |
#156-4045 | to sterilize AHL solution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cartridge Materials | |||
| 200 µL pipette tip | VWR Radnor PA USA |
53508-810 | to make odor cartridges and fly prep |
| Filter Paper | Whatman Maidstone Kent UK |
740-E | to make odor cartridges |
| Vacuum Desiccator | Cole-Parmer Vernon Hills IL USA |
VX-06514-30 | to vaporize ethanol solvent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Odorant Materials | |||
| cis-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#10009871 (CAS # 373-49-9) | Or47b odorant |
| trans-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#9001798 (CAS # 10030-73-6) | Or47b odorant |
| Ethanol | Spectrum Chemical MFG. New Brunswick NJ USA |
E1028-500MLGL | to dilute palmitoleic acid |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rig Setup Materials | |||
| Odorant Cartridge Micromanipulator | Siskiyou Grants Pass OR USA |
MX130R | to position the olfactometer |
| Flow Vision software | Alicat Tuscon AZ USA |
FLOWVISIONSC | software to control flow rate |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-2SLPM-D | to control the flow rate for humidified air |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-500SCCM-D | to control the flow rate for odor stimulation |
| Clampex | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | Data acquisition software |
| Air delivery tube | Ace Glass Vineland NJ USA |
8802-936 | to deliver humidified air |
| 50x objective lens | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
LMPLFL50X | recording rig |
| Clampfit 10 | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | software for spike analysis |
| Igor Pro 6 | WaveMetrics Lake Oswego OR USA |
Ver. 6.37 | software for data analysis |
| Audio Monitor | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXB-AUDIS-08B | Aurally reports individual spikes |
| Extracellular Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXT-02F | to increase the amplitude of electrical signals |
| Valve Controller | Warner Instruments | VC-8 | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Recording Electrode Micromanipulator | Sutter Instruments Novato CA USA |
MP-285 | to position recording electrode |
| Headstage Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
EQ-16.0008 | to increase the amplitude of electrical signals |
| Oscilloscope | Tektronix Beaverton OR USA |
TDS2000C | Visual report of individual spikes |
Referências
- Lin, H. -. H., et al. Hormonal modulation of pheromone detection enhances male courtship success. Neuron. 90 (6), 1272-1285 (2016).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
- Silbering, A. F., et al. Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems. J Neurosci. 31 (38), 13357-13375 (2011).
- Min, S., Ai, M., Shin, S. A., Suh, G. S. B. Dedicated olfactory neurons mediating attraction behavior to ammonia and amines in Drosophila. Proc Nat Acad Sci USA. 110, 1321-1329 (2013).
- Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone. Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).
- Van der Goes van Naters, W., Carlson, J. R. Receptors and neurons for fly odors in Drosophila. Curr Biol. 17, 606-612 (2007).
- Schlief, M. L., Wilson, R. I. Olfactory processing and behavior downstream from highly selective receptor neurons. Nat Neurosci. 10 (5), 623-630 (2007).
- Laughlin, J. D., Ha, T. S., Jones, D. N. M., Smith, D. P. Activation of Pheromone-sensitive neurons is mediated by conformational activation of pheromone-binding protein. Cell. 133 (7), 1255-1265 (2008).
- Gomez-Diaz, C., Reina, J. H., Cambillau, C., Benton, R. Ligands for pheromone-sensing neurons are not conformationally activated odorant binding proteins. PLoS Biol. 11 (4), e1001546 (2013).
- Dweck, H. K. M., et al. Pheromones mediating copulation and attraction in Drosophila. Proc Nat Acad USA. 112, 2829-2835 (2015).
- Cappa, C. D., Lovejoy, E. R., Ravishankara, A. R. Evaporation rates and vapor pressures of the even-numbered C8-C18monocarboxylic acids. J Phys Chem A. 112 (17), 3959-3964 (2008).
- Kimura, K. -. I., Sato, C., Yamamoto, K., Yamamoto, D. From the back or front: the courtship position is a matter of smell and sight in Drosophila melanogaster males. J Neurogenet. 29 (1), 18-22 (2015).
- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).
- Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J Vis Exp. (36), e1-e5 (2010).
