इस प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य यह दिखाना है कि ड्रोसोफिला घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स से सिंगल-सेंसिमल रिकॉर्डिंग के लिए कम अस्थिरता के odorants को कैसे प्रस्तुत किया जाए जो लंबे समय से चेन क्यूटिकर फेरोमोन का जवाब देते हैं।
कीड़े अपने बचपन के लिए महत्वपूर्ण हैं, जैसे कि भोजन की मांग, शिकारी से बचने, ऑक्सीजन और संभोग के लिए महत्वपूर्ण हैं। अलग-अलग बदलावों के असंख्य रसायनों को प्राकृतिक odorants के रूप में पहचान की गई है जो कि कीट ओल्फ़ैन्टर रीसेप्टर न्यूरॉन्स (ORN) को सक्रिय करते हैं। हालांकि, कम-अस्थिरता odorants के घ्राण प्रतिक्रियाओं का अध्ययन पारंपरिक गंध वितरण विधियों का उपयोग करते हुए इस तरह के उत्तेजनाओं को प्रभावी ढंग से प्रस्तुत करने में असमर्थता से बाधित किया गया है। यहां, हम एक ऐसी प्रक्रिया का वर्णन करते हैं जो विवो एकल-सेंसिलम रिकॉर्डिंग (एसएसआर) में कम-अस्थिरता odorants की प्रभावी प्रस्तुति की अनुमति देता है। गंध स्रोत और लक्ष्य ऊतक के बीच की दूरी को कम करके, इस पद्धति से जैविक रूप से प्रमुख लेकिन अब तक पहुंचने योग्य दुर्गंध के उपयोग के लिए अनुमति मिलती है, जिसमें पाल्मेटोलिक एसिड शामिल है, एक प्रेरक फेरोमोन जिसमें प्रेम प्रवंचना और संभोग व्यवहार 1 में शामिल ORN पर प्रभाव दिखाया गया है।हमारी प्रक्रिया इस प्रकार कीट वास और फेरोमोन संचार के अध्ययन के लिए कम-अस्थिरता odorants की मेज परख करने के लिए एक नया अवसर प्रदान करती है।
ड्रोसोफिला ORNs odorants की एक विशाल संख्या का जवाब, व्यापक रूप से लेकर कार्बन श्रृंखला लंबाई और सहित एस्टर, एल्कोहल, कीटोन, lactones, एल्डीहाइड terpenes, कार्बनिक अम्ल, amines, सल्फर यौगिकों, heterocyclics, और एरोमेटिक्स 2 कार्य समूहों, की एक किस्म के साथ, 3 परिसर के वाष्प के दबाव से संकेत दिए जाने वाले उनके भौतिक-संबंधी विशेषताओं में अलग-अलग odorants स्पष्ट रूप से भिन्न भिन्नताएं हो सकती हैं। विशेष रूप से, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के लिए जैविक रूप से संबंधित odorants उनकी अस्थिरता में काफी भिन्न हैं। उदाहरण के लिए, इरॉबाए ओआरएनओ अमोनिया 4 का जवाब देती है, जो कि अत्यधिक अस्थिर होता है, 20 डिग्री सेल्सियस पर 6,432 एमएमएचजी का वाष्प दबाव होता है। इसके विपरीत, Or67d ORNs एक नर फेरोमोन, सीआईएस- वॅकेनील एसीटेट ( सी वीए) 5 , 6 का वाष्प दबाव है, जो कि 20 डिग्री सेल्सियस पर 43 एमएमएचजी है
Ove_content "> कम अस्थिरता के odorants के घ्राण प्रतिक्रिया का अध्ययन विशेष रूप से परंपरागत गंध-वितरण विधियों के साथ चुनौतीपूर्ण है, जिसमें एक सुदूर संवाहक वाहक वायु प्रवाह के माध्यम से अपेक्षाकृत लंबी दूरी ( जैसे कई सेंटीमीटर) पर पहुंचाया जाता है। किसी दिए गए कम अस्थिरता odorant के गंध वितरण प्रणाली के डिजाइन के आधार पर, भिन्न हो सकते हैं उदाहरण के लिए, के सी वीए से ~ 40 7 पर्वतमाला एक उच्च खुराक के लिए Or67d ORNs की प्रतिक्रिया -।> 200 spikes / एस 6 । इसके अलावा, पारंपरिक वितरण के तरीकों के साथ ग VA के अप्रभावी वितरण की संभावना झूठी नकारात्मक परिणामों के लिए, जिम्मेदार ठहराया है व्याख्या यह है कि सी वीए अपने आप में Or67d ORNs 8 को सक्रिय करने के लिए पर्याप्त नहीं है के लिए अग्रणी। यह व्याख्या बाद में एक का उपयोग कर एक अन्य अध्ययन ने चुनौती दी निकट दूरी गंध-वितरण पद्धति 9। इसलिए यह आज्ञा हैकम अस्थिरता के odorants की प्रभावी प्रस्तुति के लिए एक मजबूत गंध वितरण प्रणाली विकसित करने के लिए tiveहाल ही में, हमने कई लंबी-श्रृंखला वाले कटेक्टिक्यूलर फैटी एसिड की पहचान की है जैसे ओरिएंब ओआरएनआईबी के लिए लाइग्ड्स। वे प्रकार 4 एंटेनाल ट्राइकोओड सेंसिलम (एटी 4) में रखे गए हैं लंबे-चेन फैटी एसिड odorants के बीच, हमने पाया कि पामटोलिअस एसिड एक कामोद्दीपक फेरोमोन के रूप में कार्य करता है जो पुरुष प्रणोदन को बढ़ावा देता है Or47b ORN 1 को सक्रिय करता है। हालांकि, एक पारंपरिक गंध-वितरण पद्धति का उपयोग करते हुए एक अन्य अध्ययन में, मेथिल लॉरेट को Or47b ORN से प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए दिखाया गया था, जबकि पाल्मटोलिक एसिड ने समान दूरी 10 से प्रस्तुत किए जाने पर कोई जवाब नहीं दिया। ग VA की तुलना में, लंबी श्रृंखला फैटी एसिड भी कम अस्थिर, वाष्प दबाव के साथ 25 डिग्री सेल्सियस 11 में कम से कम 0,001 mmHg हैं। लंबी श्रृंखला वाले फैटी एसिड odorants की स्वाभाविक कम अस्थिरता, जो एंटीना के माध्यम से कुशल प्रस्तुति precludesपरंपरागत गंध-वितरण प्रणाली, संभवतः झूठी-नकारात्मक परिणाम 10 के लिए जिम्मेदार थी यह असंगति कम-अस्थिरता odorants पेश करने में परंपरागत गंध-वितरण प्रणालियों की अपर्याप्तता को उजागर करती है। इससे पहले यह दिखाया गया था कि मक्खी कट्टर odors के प्रभावी वितरण की आवश्यकता है गंध स्रोत और लक्ष्य ऊतक 6 के बीच निकटता। इस प्रकार, जैविक रूप से सक्रिय फेरोमोन के प्रभावों को पूर्ण रूप से चिह्नित करने के लिए दूरी की नक़ल करते हुए वे प्रकृति 12 , 13 में फल मक्खियों से सामना कर रहे हैं जिसकी नकल करते हुए हम सहमत हुए कि हमारी प्रक्रिया में न्यूनतम दूरी को उच्च प्राथमिकता दी जानी चाहिए।
हमारे विधि में मानक इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी रिसाव और तकनीकों के साथ संगतता सहित अधिक फायदे हैं। पूर्व-मौजूदा रिग सेटअपों को इस प्रोटोकॉल को समायोजित करने के लिए न्यूनतम संशोधन की आवश्यकता होती है, और अधिकांश SSR चरणों में केवल मामूली समायोजन की आवश्यकता होती है। इसएसएसआर में अनुभवी शोधकर्ताओं के लिए हमारी तकनीक आसानी से उपलब्ध है। इसके अलावा, हमारी तकनीक कम-अस्थिरता odorants की प्रस्तुति के लिए तेज शुरुआत और ऑफसेट, न्यूरोनल प्रतिक्रिया के साथ उत्तेजना प्रसव के संबंध के लिए अनुमति देता है। अंत में, हार्डवेयर लेआउट, गंधक कारतूस के बीच तेजी से एक्सचेंजों को सुविधाजनक बनाता है, वांछित खुराक श्रृंखला पर डेटा संग्रह में तेजी लाने के लिए।
हम रेफरेंस और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड, एडल्ट हेमलिम्फ-लेक्ज (एएचएल) सॉल्यूशन, ऑडॉर डिलीवरी कारतूस, और इसी ऑल्फ़ैक्टमोमीटर की तैयारी की शुरूआत करते हैं। हम तो पॉमिटॉलिक एसिड गंध समाधान तैयार करने की चर्चा करते हैं, जिसके बाद रिकॉर्डिंग के लिए उड़ने की तैयारी होती है। हम इस पद्धति का उपयोग कर प्राप्त प्रतिनिधि डेटा पेश करने से पहले गंधी कारतूस की स्थिति का परीक्षण करने और अधिक बारीकी से जांचने के लिए एक ट्राइकोएक्स संवेदी चुनने के लिए मानदंडों पर विचार करना आगे बढ़ते हैं। अंत में, हम इस तकनीक के उपयोगी अनुप्रयोगों की खोज करके समाप्त करते हैंठीक है, कुछ समस्याओं का सामना किया, और उनके समाधान।
यहां, हमने एक ऐसी प्रक्रिया का वर्णन किया है जिसके द्वारा पॉलीटोलिक एसिड के लिए Or47b ORN की प्रतिक्रियाओं को मजबूती से प्रेरित और दर्ज किया जा सकता है। हमने अपर्याप्त फेरोमोन गंध प्रसव की समस्या का निवारण ?…
The authors have nothing to disclose.
चित्रों की मदद के लिए हम नमूना निशान और टिन की त्सांग के साथ मदद के लिए ये जांग का धन्यवाद करते हैं यह काम सी। वाईएस और एनआईएच अनुदानों के लिए रे थॉमस एडवर्ड्स फाउंडेशन के प्रारंभिक कैरियर पुरस्कार और एनआईएच अनुदान (आर 001 सी 0015 9 1 9) द्वारा समर्थित किया गया था (आर 001 सी 0009 9 7 और आर 0 डी 0 9 0 9 40) जेडब्ल्यूडब्ल्यू
Prep Setup & Miscellaneous Materials | |||
Pipette Puller Instrument | Sutter Instruments Novato CA USA |
P97 | Pipette Puller |
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments Sarasota FL USA |
1B100F-4 | to make holding rods |
Aluminosilicate Glass Capillaries | Sutter Instruments Novato CA USA |
AF100-64-10 | to make electrodes |
Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific Pittsburgh PA USA |
12-550-143 | for fly-prep station |
Permanent Double Sided Tape | Scotch St. Paul MN USA |
NA | for fly-prep station |
Upright microscope | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
BX51 | for recording rig |
Plastalina modeling clay | Van Aken North Charleston SC USA |
B0019QZMQQ | for prep station and to stablize the holding rod |
Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm | Nalgene Rochester NY USA |
#156-4045 | to sterilize AHL solution |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cartridge Materials | |||
200 µL pipette tip | VWR Radnor PA USA |
53508-810 | to make odor cartridges and fly prep |
Filter Paper | Whatman Maidstone Kent UK |
740-E | to make odor cartridges |
Vacuum Desiccator | Cole-Parmer Vernon Hills IL USA |
VX-06514-30 | to vaporize ethanol solvent |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Odorant Materials | |||
cis-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#10009871 (CAS # 373-49-9) | Or47b odorant |
trans-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#9001798 (CAS # 10030-73-6) | Or47b odorant |
Ethanol | Spectrum Chemical MFG. New Brunswick NJ USA |
E1028-500MLGL | to dilute palmitoleic acid |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Rig Setup Materials | |||
Odorant Cartridge Micromanipulator | Siskiyou Grants Pass OR USA |
MX130R | to position the olfactometer |
Flow Vision software | Alicat Tuscon AZ USA |
FLOWVISIONSC | software to control flow rate |
Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-2SLPM-D | to control the flow rate for humidified air |
Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-500SCCM-D | to control the flow rate for odor stimulation |
Clampex | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | Data acquisition software |
Air delivery tube | Ace Glass Vineland NJ USA |
8802-936 | to deliver humidified air |
50x objective lens | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
LMPLFL50X | recording rig |
Clampfit 10 | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | software for spike analysis |
Igor Pro 6 | WaveMetrics Lake Oswego OR USA |
Ver. 6.37 | software for data analysis |
Audio Monitor | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXB-AUDIS-08B | Aurally reports individual spikes |
Extracellular Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXT-02F | to increase the amplitude of electrical signals |
Valve Controller | Warner Instruments | VC-8 | to control the opening of the valve for odor stimulation |
Recording Electrode Micromanipulator | Sutter Instruments Novato CA USA |
MP-285 | to position recording electrode |
Headstage Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
EQ-16.0008 | to increase the amplitude of electrical signals |
Oscilloscope | Tektronix Beaverton OR USA |
TDS2000C | Visual report of individual spikes |