からの電気生理学的記録<em>ショウジョウバエ</em>低揮発性の臭気物質に対するトリコイドセンシラ
Summary
このプロトコールの全体的な目標は、長鎖クチクラフェロモンに応答するショウジョウバエの嗅覚受容体ニューロンからの単一感覚記録のための低揮発性の付臭剤を提示する方法を示すことである。
Abstract
昆虫は、食物探索、捕食者回避、産卵、交尾など、生存に不可欠な幅広い行動を導くために、嗅覚に頼っています。変化する揮発性の無数の化学物質は、昆虫の嗅覚受容器ニューロン（ORN）を活性化する天然臭気物質として同定されている。しかしながら、低揮発性臭気物質に対する嗅覚応答の研究は、従来の臭気伝達方法を用いてそのような刺激を効果的に提示することができないことによって妨げられてきた。ここでは、インビボ Single-Sensillum Recording（SSR）の低揮発性臭気物質の効果的な提示を可能にする手順を説明します。臭気源と標的組織との間の距離を最小にすることによって、この方法は、生物学的に顕著なのアプリケーションが、パルミトレイン酸、求愛と交尾行動1に関与ORN類で実証効果を有する刺激性フェロモンを含むこれまでアクセスできない着臭剤、を可能にします。従って、我々の手順は、昆虫嗅覚およびフェロモン通信の研究のための低揮発性臭気物質の宿主をアッセイする新しい手段を提供する。
Introduction
ショウジョウバエ ORNは、エステル、アルコール、ケトン、ラクトン、アルデヒド、テルペン、有機酸、アミン、硫黄化合物、複素環および芳香族化合物を含む広範な炭素鎖長および様々な官能基を有する膨大な数の匂い物質に反応する2 、 3 。それらの物理化学的特徴が異なる匂い物質は、化合物の蒸気圧によって示される顕著に異なる揮発性を有することができる。特に、 ショウジョウバエのメラノガスターの生物学的に関連する臭気物質は、そのボラティリティにおいて著しく異なる。例えば、Ir92a ORNは、20℃で6322Hgの蒸気圧で、非常に揮発性の高いアンモニア4に反応します。対照的に、Or67d ORN類は男性フェロモン、 シス -vaccenyl酢酸（C VA）5、6、20°Cで43 mmHgであるの蒸気圧に応答します。
低揮発性の匂い物質に対する嗅覚応答の研究は、匂い物質が比較的長い距離（ すなわち、数センチメートル）にわたって担体空気流を介して送達される従来の匂い送達方法では特に困難である。所定の低揮発性臭気物質に臭気デリバリーシステムの設計に依存して、大きく変化することができ、例えば、C VAの高用量にOr67d ORN類の報告された応答は、約40 7の範囲である- > 200スパイク/秒6さらに、従来の送達方法とCの VAの無効送達がそうVA C単独ではOr67d ORN類8を活性化するのに十分ではないという解釈につながる、偽陰性の結果に起因する。この解釈は、後で使用する別の研究によりチャレンジしました近距離匂い送達方法9それゆえ、それはイペラ低揮発性の臭気物質を効果的に提示するための強力な臭気供給システムを開発しています。最近、我々は、Or47b ORNのリガンドとしていくつかの長鎖クチクラ脂肪酸を同定した。彼らはタイプ4 Antennal Trichoid Sensillum（at4）に収容されています。長鎖脂肪酸臭気物質の中で、我々はOr47bのORN類1を活性化することにより、男性の求愛を促進媚薬フェロモンとしてそのパルミトレイン酸機能を発見しました。しかし、従来の臭気送達法を用いた別の研究では、ラウリン酸メチルはOr47b ORNからの応答を誘発することが示されたが、パルミトレイン酸は同じ距離から提示された場合に応答を示さなかった10 。 VA Cと比較して、長鎖脂肪酸は、25°C 11未満で0.001 mmHgの蒸気圧であっても低揮発性です。長鎖脂肪酸臭気物質の本質的に低い揮発性は、経由するアンテナへの効率的な提示を妨げる。従来の匂いデリバリーシステムは、偽陰性の結果である可能性が高い10 。この不一致は、低揮発性臭気物質を提示する際の従来の匂い供給システムの不備を強調する。フライクチクラの臭いの効果的な送達には、臭気源と標的組織との間の近接性が必要であることが以前に示された6 。このように、完全に彼らはおそらく、自然12、13でショウジョウバエが遭遇され、そこから距離を模倣しながら、生物学的に活性なフェロモンの効果を特徴づけるために、我々は、最小距離が私たちの手順に高い優先順位を与えられる必要があることに同意しました。
我々の方法は、標準的な電気生理学リグおよび技術との互換性を含むさらなる利点を保持する。既存のリグセットアップでは、このプロトコルに対応するために最小限の変更が必要です。ほとんどのSSR手順では、わずかな調整しか必要ありません。この我々の技術はSSRで経験された研究者に容易にアクセス可能にする。さらに、我々の技術は、神経応答と刺激伝達を相関させる、鋭い発症およびオフセットを伴う低揮発性臭気物質の提示を可能にする。最後に、ハードウェアレイアウトは、ニオイのカートリッジ間の迅速な交換を容易にし、所望の用量範囲にわたってデータ収集を迅速化する。
我々は、参照電極および記録電極、成人ヘムリンパ様（AHL）溶液、付臭剤送達カートリッジ、および対応する嗅覚器の調製を検討することから始める。次に、パルミトレイン酸臭気物質溶液の調製、その後の記録用フライの調製について議論する。我々は、この方法を使用して得られた代表的なデータを提示する前に、トリコイド感知物質を選択し、付臭剤カートリッジの位置をより詳細に記録するための基準を検討することに進む。最後に、このtechniqの有用なアプリケーションを調べることで結論づけますue、いくつかの遭遇した問題、およびその解決策。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、Or47b ORNのパルミトレイン酸に対する応答を強く誘発し、記録することができる手順を記載した。我々は不十分フェロモン臭気物質の送達の問題を解決するために、従来の長距離臭気配信方法2、7、10を修正しました。臭気物質カートリッジを介して化合物を送達することにより、低い臭気物質の揮発性の問題に?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちはサンプルの痕跡とTin Ki Tsangの助けを借りて、絵の助けを借りてYe Zhangに感謝します。この研究は、レイ・トーマス・エドワーズの早期キャリア賞とC.-YSおよびNIHグラント（R01DC009597およびR01DK092640）のNIHグラント（R01DC015519）がJWW
Materials
| Prep Setup & Miscellaneous Materials | |||
| Pipette Puller Instrument | Sutter Instruments Novato CA USA |
P97 | Pipette Puller |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments Sarasota FL USA |
1B100F-4 | to make holding rods |
| Aluminosilicate Glass Capillaries | Sutter Instruments Novato CA USA |
AF100-64-10 | to make electrodes |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific Pittsburgh PA USA |
12-550-143 | for fly-prep station |
| Permanent Double Sided Tape | Scotch St. Paul MN USA |
NA | for fly-prep station |
| Upright microscope | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
BX51 | for recording rig |
| Plastalina modeling clay | Van Aken North Charleston SC USA |
B0019QZMQQ | for prep station and to stablize the holding rod |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm | Nalgene Rochester NY USA |
#156-4045 | to sterilize AHL solution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cartridge Materials | |||
| 200 µL pipette tip | VWR Radnor PA USA |
53508-810 | to make odor cartridges and fly prep |
| Filter Paper | Whatman Maidstone Kent UK |
740-E | to make odor cartridges |
| Vacuum Desiccator | Cole-Parmer Vernon Hills IL USA |
VX-06514-30 | to vaporize ethanol solvent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Odorant Materials | |||
| cis-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#10009871 (CAS # 373-49-9) | Or47b odorant |
| trans-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#9001798 (CAS # 10030-73-6) | Or47b odorant |
| Ethanol | Spectrum Chemical MFG. New Brunswick NJ USA |
E1028-500MLGL | to dilute palmitoleic acid |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rig Setup Materials | |||
| Odorant Cartridge Micromanipulator | Siskiyou Grants Pass OR USA |
MX130R | to position the olfactometer |
| Flow Vision software | Alicat Tuscon AZ USA |
FLOWVISIONSC | software to control flow rate |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-2SLPM-D | to control the flow rate for humidified air |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-500SCCM-D | to control the flow rate for odor stimulation |
| Clampex | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | Data acquisition software |
| Air delivery tube | Ace Glass Vineland NJ USA |
8802-936 | to deliver humidified air |
| 50x objective lens | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
LMPLFL50X | recording rig |
| Clampfit 10 | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | software for spike analysis |
| Igor Pro 6 | WaveMetrics Lake Oswego OR USA |
Ver. 6.37 | software for data analysis |
| Audio Monitor | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXB-AUDIS-08B | Aurally reports individual spikes |
| Extracellular Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXT-02F | to increase the amplitude of electrical signals |
| Valve Controller | Warner Instruments | VC-8 | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Recording Electrode Micromanipulator | Sutter Instruments Novato CA USA |
MP-285 | to position recording electrode |
| Headstage Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
EQ-16.0008 | to increase the amplitude of electrical signals |
| Oscilloscope | Tektronix Beaverton OR USA |
TDS2000C | Visual report of individual spikes |
Referências
- Lin, H. -. H., et al. Hormonal modulation of pheromone detection enhances male courtship success. Neuron. 90 (6), 1272-1285 (2016).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
- Silbering, A. F., et al. Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems. J Neurosci. 31 (38), 13357-13375 (2011).
- Min, S., Ai, M., Shin, S. A., Suh, G. S. B. Dedicated olfactory neurons mediating attraction behavior to ammonia and amines in Drosophila. Proc Nat Acad Sci USA. 110, 1321-1329 (2013).
- Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone. Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).
- Van der Goes van Naters, W., Carlson, J. R. Receptors and neurons for fly odors in Drosophila. Curr Biol. 17, 606-612 (2007).
- Schlief, M. L., Wilson, R. I. Olfactory processing and behavior downstream from highly selective receptor neurons. Nat Neurosci. 10 (5), 623-630 (2007).
- Laughlin, J. D., Ha, T. S., Jones, D. N. M., Smith, D. P. Activation of Pheromone-sensitive neurons is mediated by conformational activation of pheromone-binding protein. Cell. 133 (7), 1255-1265 (2008).
- Gomez-Diaz, C., Reina, J. H., Cambillau, C., Benton, R. Ligands for pheromone-sensing neurons are not conformationally activated odorant binding proteins. PLoS Biol. 11 (4), e1001546 (2013).
- Dweck, H. K. M., et al. Pheromones mediating copulation and attraction in Drosophila. Proc Nat Acad USA. 112, 2829-2835 (2015).
- Cappa, C. D., Lovejoy, E. R., Ravishankara, A. R. Evaporation rates and vapor pressures of the even-numbered C8-C18monocarboxylic acids. J Phys Chem A. 112 (17), 3959-3964 (2008).
- Kimura, K. -. I., Sato, C., Yamamoto, K., Yamamoto, D. From the back or front: the courtship position is a matter of smell and sight in Drosophila melanogaster males. J Neurogenet. 29 (1), 18-22 (2015).
- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).
- Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J Vis Exp. (36), e1-e5 (2010).
