Påvisning af Enterohemorrhagic Escherichia Coli kolonisering i Murine vært ved Non-invasiv In Vivo bioluminescens System
Summary
En detaljeret protokol i en musemodel for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) kolonisering ved hjælp af bioluminescens-mærket bakterier er præsenteret. Påvisning af disse en bioluminescerende bakterier af en non-invasiv i vivo imaging system med levende dyr kan rykke vores nuværende forståelse af EHEC kolonisering.
Abstract
Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157: H7, som er en fødevarebårne patogen, causesdiarrhea, blødende tarmbetændelse (HS), og Hæmolytisk uræmisk syndrom (HUS), kolonisere til tarmkanalen i mennesker. For at studere den detaljerede mekanisme af EHEC kolonisering in vivo er det vigtigt at have dyremodeller for at overvåge og kvantificere EHEC kolonisering. Vi viser her en mus-EHEC kolonisering model ved at omdanne den en bioluminescerende udtrykker plasmid til EHEC til at overvåge og kvantificere EHEC kolonisering i levende værter. Dyr podet med bioluminescens-mærket EHEC vise intens en bioluminescerende signaler i mus ved registrering med en non-invasiv i vivo imaging system. Efter 1-2 dage efter infektion, kunne en bioluminescerende signaler stadig kunne påvises i inficerede dyr, hvilket tyder på, at EHEC kolonisere hosts i mindst 2 dage. Vi viser også, at disse en bioluminescerende EHEC lokalisere til musen tarmen, specielt i cecum og colon, fra ex vivo billeder. Denne mus-EHEC kolonisering model kan tjene som et redskab til at fremme den aktuelle viden om EHEC kolonisering mekanisme.
Introduction
EHEC O157: H7 er en patogen, der forårsager diarré1, HS2, HUS3og endda akut nyresvigt4 gennem forurenet vand eller mad. EHEC er en sygdomsfremkaldende enterobacterium og koloniserer til mavetarmkanalen hos mennesker1. Når EHEC overholder første vært intestinale epitel, injicere de kolonisering faktorer i værtsceller gennem type III sekretion system (T3SS), der fungerer som en molekylær sprøjte inducere en montering og effacing (A/E) læsion efterfølgende til at håndhæve friktion (kolonisering)5. Disse gener involveret i A/E læsion dannelse er kodet af locus af enterocyte effacement (LEE) patogenicitet ø5.
Bioluminescens er en lys-producerende kemiske reaktion, i hvilke luciferase katalyserer sit Bæremateriale luciferin for at generere synligt lys6. Denne enzymatiske proces kræver ofte tilstedeværelse af ilt eller adenosin trifosfat (ATP)6. Bioluminescens imaging (BLI) tillader forskere visualisering og kvantisering af vært-patogen interaktioner i levende dyr7. BLI kan karakterisere den bakterielle infektion cyklus i levende dyr ved at følge en bioluminescerende bakterier som de vandrer til og invadere forskellige væv7; Dette afslører en dynamisk progression af infektion. Derudover er bakteriemængde i dyr, der relateret til en bioluminescerende signal8; Det er således en bekvem indikator til at anslå de patologiske tilstande af forsøgsdyr i en enkel og direkte måde.
Plasmid brugt her indeholdt luciferase operonen, luxCDABE, som er fra bakterien Photorhabdus luminescens der koder sin egen luciferase substrat7,9. Ved at omdanne denne luciferase-udtrykker plasmid til bakterier, kan kolonisering og infektion processer overvåges ved at observere disse en bioluminescerende bakterier med levende dyr. Samlet set giver BLI og bioluminescens-mærket bakterier forskere til at overvåge bakteriel numre og placering, bakteriel levedygtighed med antibiotika/terapi behandling og bakteriel genekspression i infektion/kolonisering6, 7. mange patogene bakterier er blevet rapporteret at udtrykke luxCDABE operon at undersøge deres infektion cyklus og/eller gen udtryk i infektion. Disse bakterier, herunder uropathogenic E. coli10, EHEC8,11,12,13, enteropathogenic E. coli (EPEC)8, Citrobacter rodentium14,15, Salmonella typhimurium16, Listeria monocytogenes17, Yersinia enterocolitica18,19, og Vibrio cholerae20, er blevet dokumenteret.
Flere eksperimentelle modeller er blevet udviklet for at lette undersøgelsen af EHEC kolonisering i in vitro og i vivo21,22,23. Dog er der en mangel på egnet dyremodeller for at studere EHEC kolonisering i vivo, og dermed en deraf følgende mangel på detaljer. For at lette undersøgelsen af EHEC kolonisering mekanisme i vivo, er det værdifuldt at bygge dyremodeller for at observere og kvantificere EHEC kolonisering med levende dyr i en ikke-invasiv metode.
Dette manuskript beskriver en mus-EHEC kolonisering model, der bruger en en bioluminescerende udtrykker system til at overvåge EHEC colonization over tid i levende værter. Mus podes intragastrically med bioluminescens-mærket EHEC og en bioluminescerende signalet registreres i mus med en non-invasiv i vivo imaging system13. Mus inficeret med bioluminescens-mærket EHEC viste betydelig en bioluminescerende signaler i deres tarmen efter 2 dage efter infektion, som foreslog, at disse bakterier koloniseret i vært tarmen efter 2 dage efter infektion. Ex vivo billeddata viste, at denne colonization er specielt i cecum og colon af mus. Ved hjælp af denne mus-EHEC model, kan en bioluminescerende EHEC kolonisering afsløres i den levende vært ved en i vivo imaging system, for at studere de detaljerede mekanismer af enteriske bakterier kolonisering, som kan fremme yderligere forståelse i EHEC-induceret fysiologiske og patologiske ændringer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er blevet rapporteret, at EHEC omdannet med luciferase plasmid er blevet udnyttet til at undersøge dens lokalisering i værter eller gen udtryk i vivo8,11,12. Murine modellen demonstreret her er også blevet rapporteret til at opdage EHEC koloniseret timing og lokalisering i murine vært8. Ikke desto mindre, vi leverer detaljer protokollen af hvordan du administrere EHEC podning til mus intr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender Chi-Chung Chen fra Institut for medicinalforskning, Chi Mei Medical Center (Tainan, Taiwan) for hjælpen i mus, infektion, og støtte fra byens laboratorium dyr af National Cheng Kung University. Dette arbejde støttes af Minister for videnskab og teknologi (de fleste) tilskud (mest 104-2321-B-006-019, 105-2321-B-006-011, and106-2321-B-006-005) til CC.
Materials
| Shaker incubator | YIH DER | LM-570R | bacteria incubation |
| Orbital shaking incubator | FIRSTEK | S300 | bacteria incubation |
| pBSL180 | source of nptII gene | ||
| pAKlux2 | source of luxCDABE operon | ||
| T&A Cloning Kit | Yeastern Biotech | FYC001-20P | use for TA cloning |
| Nsi I | NEB | R0127S | use for plasmid cloning |
| Sca I | NEB | R0122S | use for plasmid cloning |
| Spe I-HF | NEB | R0133S | use for plasmid cloning |
| Sma I | NEB | R0141S | use for plasmid cloning |
| T4 ligase | NEB | M0202S | use for plasmid cloning |
| Ex Taq | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| 10X Ex Taq Buffer | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| dNTP Mixture | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| PCR machine | applied Biosystem | 2720 thermal cycler | for PCR amplification |
| Glycerol | SIGMA | G5516-1L | use for bacteria stocking solution |
| NaCl | Sigma | 31434-5KG-R | chemical for making LB medium, 10 g/L |
| Tryptone | CONDA pronadisa | Cat 1612.00 | chemical for making LB medium, 10 g/L |
| Yeast Extract powder | Affymetrix | 23547-1 KG | chemical for making LB medium, 5 g/L |
| Agar | CONDA pronadisa | Cat 1802.00 | chemical for making LB agar |
| kanamycin | Sigma | K4000-5G | antibiotics, use for seleciton |
| streptomycin | Sigma | S6501-100G | antibiotics, eliminate the microbiota in mice |
| EDL933 competent cell | Homemade | method is on supplemental document | |
| Electroporator | MicroPulser | for electroporation | |
| Electroporation Cuvettes | Gene Pulser/MicroPulser | 1652086 | for electroporation |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti, J-26S XP | use for centrifuging bacteria |
| Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | JA25.5 | use for centrifuging bacteria |
| Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | JLA10.5 | use for centrifuging bacteria |
| centrifuge bottles | Beckman Coulter | REF357003 | use for centrifuging bacteria |
| centrifuge bottles | Thermo Fisher scientific | 3141-0500 | use for centrifuging bacteria |
| eppendorf biophotometer plus | eppendorf | AG 22331 hamburg | for measuring the OD600 value of bacteria |
| C57BL/6 mice | Laboratory Animal Center of NCKU | ||
| lab coat, gloves | for personnel protection | ||
| isoflurane | Panion & BF Biotech Inc. | G-8669 | for mice anesthesia, pharmaceutical grade |
| 1ml syringe | use for oral gavage of mice | ||
| Reusable 22 G ball-tipped feeding needle | φ0.9 mm X L 50 mm | use for oral gavage of mice | |
| surgical scissors | use for mice experiment | ||
| Xenogen IVIS 200 imaging system | Perkin Elmer | IVIS spectrum | use for bioluminescent image capture |
| Living Image Software | Perkin Elmer | version 4.1 | use for quantifying the image data |
Referências
- Pennington, H. Escherichia coli O157. Lancet. 376 (9750), 1428-1435 (2010).
- Mayer, C. L., Leibowitz, C. S., Kurosawa, S., Stearns-Kurosawa, D. J. Shiga toxins and the pathophysiology of hemolytic uremic syndrome in humans and animals. Toxins (Basel). 4 (11), 1261-1287 (2012).
- Tarr, P. I., Gordon, C. A., Chandler, W. L. Shiga-toxin-producing Escherichia coli and haemolytic uraemic syndrome. Lancet. 365 (9464), 1073-1086 (2005).
- Obrig, T. G. Escherichia coli Shiga Toxin Mechanisms of Action in Renal Disease. Toxins (Basel). 2 (12), 2769-2794 (2010).
- Nguyen, Y., Sperandio, V. Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) pathogenesis. Front Cell Infect Microbiol. 2, 90 (2012).
- Wiles, S., Robertson, B. D., Frankel, G., Kerton, A. Bioluminescent monitoring of in vivo colonization and clearance dynamics by light-emitting bacteria. Methods Mol Biol. 574, 137-153 (2009).
- Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cell Microbiol. 9 (10), 2315-2322 (2007).
- Rhee, K. J., et al. Determination of spatial and temporal colonization of enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli in mice using bioluminescent in vivo imaging. Gut Microbes. 2 (1), 34-41 (2011).
- Karsi, A., Lawrence, M. L. Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria. Plasmid. 57 (3), 286-295 (2007).
- Lane, M. C., Alteri, C. J. S., Smith, S. N., Mobley, L. H. Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (42), 16669-16674 (2007).
- Roxas, J. L., et al. Enterohemorrhagic E. coli alters murine intestinal epithelial tight junction protein expression and barrier function in a Shiga toxin independent manner. Lab Invest. 90 (8), 1152-1168 (2010).
- Siragusa, G. R., Nawotka, K., Spilman, S. D., Contag, P. R., Contag, C. H. . Real-Time Monitoring of Escherichia coli O157:H7 Adherence to Beef Carcass Surface Tissues with a Bioluminescent Reporter. , (1999).
- Kuo, C. J., et al. Mutation of the Enterohemorrhagic Escherichia coli Core LPS Biosynthesis Enzyme RfaD Confers Hypersusceptibility to Host Intestinal Innate Immunity In vivo. Front Cell Infect Microbiol. 6, 82 (2016).
- Wiles, S., et al. Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium. Cell Microbiol. 6 (10), 963-972 (2004).
- Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium. Infect Immun. 74 (9), 5391-5396 (2006).
- Contag, C. H., Contag, P. R., Mullins, J. I., Spillman, S. D., Stevenson, D. K., Benaron, D. A. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).
- Hardy, J., Francis, K. P., DeBoer, M., Chu, P., Gibbs, K., Contag, C. H. Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder. Science. 303 (5659), 851-853 (2004).
- Kaniga, K., Sory, M. P., Delor, I., Saegerman, C., Limet, J. N., Cornelis, G. R. Monitoring of Yersinia enterocolitica in Murine and Bovine Feces on the Basis of the Chromosomally Integrated luxAB Marker Gene. Appl Environ Microbiol. 58 (3), 1024-1026 (1992).
- Trcek, J., Fuchs, T. M., Trulzsch, K. Analysis of Yersinia enterocolitica invasin expression in vitro and in vivo using a novel luxCDABE reporter system. Microbiology. 156 (Pt 9), 2734-2745 (2010).
- Morin, C. E., Kaper, J. B. Use of stabilized luciferase-expressing plasmids to examine in vivo-induced promoters in the Vibrio cholerae vaccine strain CVD 103-HgR. FEMS Immunol Med Microbiol. 57 (1), 69-79 (2009).
- Law, R. J., Gur-Arie, L., Rosenshine, I., Finlay, B. B. In vitro and in vivo model systems for studying enteropathogenic Escherichia coli infections. Cold Spring Harb Perspect Med. 3 (3), a009977 (2013).
- Ritchie, J. M. Animal Models of Enterohemorrhagic Escherichia coli Infection. Microbiol Spectr. 2 (4), EHEC-0022-2013 (2014).
- Chou, T. C., et al. Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Shiga-like toxin 1 is required for full pathogenicity and activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in Caenorhabditis elegans. Cell Microbiol. 15 (1), 82-97 (2013).
- Alexeyev, M. F., Shokolenko, I. N. Mini-Tnl 0 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of Gram-negative bacteria. Gene. 160 (1), 59-62 (1995).
- Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).
- Pansare, V., Hejazi, S., Faenza, W., Prud’homme, R. K. Review of Long-Wavelength Optical and NIR Imaging Materials: Contrast Agents, Fluorophores and Multifunctional Nano Carriers. Chem Mater. 24 (5), 812-827 (2012).
- Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. Improved green fluorescence. Nature. 373 (6516), 663-664 (1995).
- Weissleder, R. A clearer vision for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 19 (4), 316-317 (2001).
- Frangioni, J. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 626-634 (2003).
- Collins, J. W., et al. Citrobacter rodentium: infection, inflammation and the microbiota. Nat Rev Microbiol. 12 (9), 612-623 (2014).
- Mallick, E. M., et al. A novel murine infection model for Shiga toxin-producing Escherichia coli. J Clin Invest. 122 (11), 4012-4024 (2012).
- Petty, N. K., et al. The Citrobacter rodentium genome sequence reveals convergent evolution with human pathogenic Escherichia coli. J Bacteriol. 192 (2), 525-538 (2010).
- Kovach, M. E., Elzer, P. H., Hill, D. S., Robertson , G. T., Farris, M. A., Roop, R. M., Peterson, K. M. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 166 (1), 175-176 (1995).
- Galen, J. E., Nair, J., Wang , J. Y., Wasserman, S. S., Tanner, M. K., Sztein , M. B., Levine, M. M. Optimization of Plasmid Maintenance in the Attenuated Live Vector Vaccine Strain Salmonella typhiCVD 908-htrA. Infect Immun. 67 (12), 6424-6433 (1999).
- Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infect Immun. 69 (5), 3350-3358 (2001).
- Goldwater, P. N., Bettelheim, K. A. Treatment of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infection and hemolytic uremic syndrome (HUS). BMC Med. 10, (2012).
