Vivo Bioluminescence System में गैर-इनवेसिव द्वारा Murine होस्ट में Enterohemorrhagic ई कोलाई औपनिवेशीकरण का पता लगाना
Summary
bioluminescence-लेबल किए गए बैक्टीरिया का उपयोग करके enterohemorrhagic ई. कोलाई (EHEC) औपनिवेशीकरण के लिए माउस मॉडल का एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है । एक गैर द्वारा इन bioluminescent बैक्टीरिया का पता लगाने के जीवित पशुओं में vivo इमेजिंग प्रणाली में इनवेसिव EHEC औपनिवेशीकरण की हमारी वर्तमान समझ अग्रिम कर सकते हैं ।
Abstract
Enterohemorrhagic ई. कोलाई (EHEC) O157: H7, जो एक foodborne रोगज़नक़ कि causesdiarrhea, रक्तस्रावी कोलाइटिस (एच एस), और रक्तलायी uremic सिंड्रोम (ःस), मनुष्यों के आंत्र पथ के लिए उपनिवेश है । vivo में EHEC औपनिवेशीकरण के विस्तृत तंत्र का अध्ययन करने के लिए, यह EHEC औपनिवेशीकरण पर नजर रखने और अंदाज लगाने के लिए पशु मॉडलों के लिए आवश्यक है । हम यहां एक माउस-EHEC औपनिवेशीकरण मॉडल को बदलने के लिए EHEC एक्सप्रेस प्लाज्मिड के लिए निगरानी और रहने वाले मेजबान में EHEC औपनिवेशीकरण यों को दर्शाता है । bioluminescence के साथ inoculated जानवरों-लेबल EHEC vivo इमेजिंग प्रणाली में एक गैर इनवेसिव के साथ पता लगाने के द्वारा चूहों में तीव्र bioluminescent संकेतों दिखाएँ. 1 और 2 दिनों के बाद संक्रमण के बाद, bioluminescent संकेतों अभी भी संक्रमित पशुओं में पता लगाया जा सकता है, जो पता चलता है कि EHEC उपनिवेश मेजबान में कम 2 दिनों के लिए । हम यह भी प्रदर्शित करते है कि इन bioluminescent EHEC माउस आंत को खोजने के लिए, विशेष रूप से अंधान्त्र और बृहदांत्र में, पूर्व vivo छवियों से । इस माउस-EHEC औपनिवेशीकरण मॉडल EHEC औपनिवेशीकरण तंत्र के वर्तमान ज्ञान अग्रिम करने के लिए एक उपकरण के रूप में सेवा कर सकते हैं ।
Introduction
EHEC O157: H7 एक रोगज़नक़ कि दस्त का कारण बनता है1, एच एस2, ःस3, और यहां तक कि तीव्र गुर्दे की विफलता4 दूषित पानी या भोजन के माध्यम से. EHEC एक रोगजनक enterobacterium और उपनिवेश करता मनुष्यों के जठरांत्र संबंधी मार्ग के लिए है 1 । जब EHEC पहले आंत्र उपकला मेजबान का पालन करें, वे प्रकार III स्राव प्रणाली के माध्यम से मेजबान कोशिकाओं में औपनिवेशीकरण कारकों सुई (T3SS) कि एक आणविक एक संलग्न और effacing के रूप में उत्प्रेरण सिरिंज के रूप में कार्य करता है (एक/ई) घाव बाद में लागू करने के लिए आसंजन (औपनिवेशीकरण)5. ए/ई घावों के गठन में शामिल इन जीनों enterocyte effacement (ली) pathogenicity द्वीप5के लोकस द्वारा इनकोडिंग हैं ।
Bioluminescence एक प्रकाश उत्पादन रासायनिक प्रतिक्रिया है, जिसमें luciferase catalyzes अपने सब्सट्रेट luciferin दृश्य प्रकाश6उत्पन्न करने के लिए है. इस एंजाइमी प्रक्रिया में अक्सर ऑक्सीजन या adenosine ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) की उपस्थिति की आवश्यकता होती है6. Bioluminescence इमेजिंग (BLI) शोधकर्ताओं दृश्य और मेजबान के परिमाणीकरण-रहते जानवरों में रोगज़नक़ बातचीत की अनुमति देता है7. BLI bioluminescent बैक्टीरिया का पालन करके जीवित पशुओं में जीवाणु संक्रमण चक्र को चिह्नित कर सकते हैं के रूप में वे करने के लिए विस्थापित और विभिन्न ऊतकों पर आक्रमण7; यह संक्रमण की एक गतिशील प्रगति का पता चलता है । इसके अलावा, जानवरों में बैक्टीरियल लोड bioluminescent संकेत से संबंधित है8; इस प्रकार, एक सरल और प्रत्यक्ष तरीके से प्रयोगात्मक पशुओं की रोग स्थितियों का अनुमान लगाने के लिए एक सुविधाजनक संकेतक है ।
प्लाज्मिड यहां इस्तेमाल किया luciferase ऑपरोन, luxCDABE, जो जीवाणु Photorhabdus luminescens है कि अपने luciferase सब्सट्रेट7,9encodings से है निहित । इस luciferase-व्यक्त प्लाज्मिड को जीवाणुओं में परिवर्तित करके, औपनिवेशीकरण और संक्रमण प्रक्रियाओं को जीवित पशुओं में इन bioluminescent जीवाणुओं को देख कर निगरानी की जा सकती है. कुल मिलाकर, BLI और bioluminescence-लेबल बैक्टीरिया जीवाणु संख्या और स्थान की निगरानी करने के लिए शोधकर्ताओं की अनुमति, एंटीबायोटिक दवाओं के साथ बैक्टीरियल व्यवहार्यता/औपनिवेशीकरण6, और जीवाणु जीन अभिव्यक्ति संक्रमण में/ 7. कई रोगजनक बैक्टीरिया सूचित किया गया है कि एक्सप्रेस luxCDABE ऑपरोन अपने संक्रमण चक्र और संक्रमण में जीन अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए । ये जीवाणु, जिनमें uropathogenic ई. कोलाई10, EHEC8,11,12,13, enteropathogenic ई. कोलाई (EPEC)8, Citrobacter rodentium14,15, साल्मोनेला typhimurium16, लिस्टिरिया monocytogenes17, Yersinia enterocolitica18,19, और Vibrio हैजा20, प्रलेखित किया गया है ।
कई प्रायोगिक मॉडल विकसित किया गया है EHEC औपनिवेशीकरण के अध्ययन की सुविधा के लिए इन विट्रो में और vivo में21,22,23. हालांकि, वहां उपयुक्त पशु मॉडलों की कमी के लिए vivo मेंEHEC औपनिवेशीकरण अध्ययन है, और इस तरह के विवरण के परिणामस्वरूप धनाभाव । vivo मेंEHEC औपनिवेशीकरण तंत्र के अध्ययन की सुविधा के लिए, यह एक गैर इनवेसिव विधि में जीवित पशुओं में EHEC औपनिवेशीकरण का पालन करने के लिए पशु मॉडल का निर्माण करने के लिए मूल्यवान है ।
इस पांडुलिपि का वर्णन एक माउस-EHEC औपनिवेशीकरण मॉडल है कि एक bioluminescent एक्सप्रेस प्रणाली का उपयोग करता है EHEC औपनिवेशीकरण के रहने वाले मेजबान में समय पर नजर रखने के लिए । चूहों bioluminescence-लेबल EHEC के साथ intragastrically inoculated है और bioluminescent संकेत चूहों में एक गैर इनवेसिव vivo इमेजिंग प्रणाली13 में पता चला है. चूहों bioluminescence से संक्रमित-लेबल EHEC 2 दिनों के बाद संक्रमण, जो सुझाव दिया कि उन बैक्टीरिया मेजबान आंत में बृहदांत्र के बाद 2 दिन के बाद संक्रमण के बाद उनकी आंत में महत्वपूर्ण bioluminescent संकेत दिखाया । पूर्व विवो छवि डेटा से पता चला है कि यह औपनिवेशीकरण विशेष रूप से चूहों की अंधान्त्र और बृहदांत्र में है । इस माउस-EHEC मॉडल का उपयोग करके, bioluminescent EHEC औपनिवेशीकरण में एक vivo इमेजिंग प्रणाली द्वारा जीवित मेजबान में पता लगाया जा सकता है, के लिए प्रवेश बैक्टीरिया औपनिवेशीकरण के विस्तृत तंत्र का अध्ययन, जो आगे की समझ को बढ़ावा देने में हो सकता है EHEC-प्रेरित शारीरिक और रोग परिवर्तन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह बताया गया है कि luciferase प्लाज्मिड के साथ रूपांतरित EHEC को विवो8,11,12 मेंमेजबान या जीन अभिव्यक्ति में अपने स्थानीयकरण की जांच करने के लिए उपयोग किया गया है । murine मॉडल यहा?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम ची चिकित्सा अनुसंधान विभाग से चुंग चेन स्वीकार करते हैं, ची मेई चिकित्सा केंद्र (ताइनान, ताइवान) माउस संक्रमण में मदद के लिए, और राष्ट्रीय चेंग कुंग विश्वविद्यालय के प्रयोगशाला पशु केंद्र से समर्थन करते हैं । इस काम के लिए विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्री (अधिकांश) अनुदान (सबसे 104-2321-बी-006-019, 105-2321-बी-006 -011, and106-2321-बी-006 -005) सीसी के लिए समर्थन किया है ।
Materials
| Shaker incubator | YIH DER | LM-570R | bacteria incubation |
| Orbital shaking incubator | FIRSTEK | S300 | bacteria incubation |
| pBSL180 | source of nptII gene | ||
| pAKlux2 | source of luxCDABE operon | ||
| T&A Cloning Kit | Yeastern Biotech | FYC001-20P | use for TA cloning |
| Nsi I | NEB | R0127S | use for plasmid cloning |
| Sca I | NEB | R0122S | use for plasmid cloning |
| Spe I-HF | NEB | R0133S | use for plasmid cloning |
| Sma I | NEB | R0141S | use for plasmid cloning |
| T4 ligase | NEB | M0202S | use for plasmid cloning |
| Ex Taq | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| 10X Ex Taq Buffer | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| dNTP Mixture | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| PCR machine | applied Biosystem | 2720 thermal cycler | for PCR amplification |
| Glycerol | SIGMA | G5516-1L | use for bacteria stocking solution |
| NaCl | Sigma | 31434-5KG-R | chemical for making LB medium, 10 g/L |
| Tryptone | CONDA pronadisa | Cat 1612.00 | chemical for making LB medium, 10 g/L |
| Yeast Extract powder | Affymetrix | 23547-1 KG | chemical for making LB medium, 5 g/L |
| Agar | CONDA pronadisa | Cat 1802.00 | chemical for making LB agar |
| kanamycin | Sigma | K4000-5G | antibiotics, use for seleciton |
| streptomycin | Sigma | S6501-100G | antibiotics, eliminate the microbiota in mice |
| EDL933 competent cell | Homemade | method is on supplemental document | |
| Electroporator | MicroPulser | for electroporation | |
| Electroporation Cuvettes | Gene Pulser/MicroPulser | 1652086 | for electroporation |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti, J-26S XP | use for centrifuging bacteria |
| Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | JA25.5 | use for centrifuging bacteria |
| Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | JLA10.5 | use for centrifuging bacteria |
| centrifuge bottles | Beckman Coulter | REF357003 | use for centrifuging bacteria |
| centrifuge bottles | Thermo Fisher scientific | 3141-0500 | use for centrifuging bacteria |
| eppendorf biophotometer plus | eppendorf | AG 22331 hamburg | for measuring the OD600 value of bacteria |
| C57BL/6 mice | Laboratory Animal Center of NCKU | ||
| lab coat, gloves | for personnel protection | ||
| isoflurane | Panion & BF Biotech Inc. | G-8669 | for mice anesthesia, pharmaceutical grade |
| 1ml syringe | use for oral gavage of mice | ||
| Reusable 22 G ball-tipped feeding needle | φ0.9 mm X L 50 mm | use for oral gavage of mice | |
| surgical scissors | use for mice experiment | ||
| Xenogen IVIS 200 imaging system | Perkin Elmer | IVIS spectrum | use for bioluminescent image capture |
| Living Image Software | Perkin Elmer | version 4.1 | use for quantifying the image data |
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