פשוט חיסול רקע זריחה ברקמת המוח האנושי פורמלין-קבוע עבור מיקרוסקופ Immunofluorescence
Summary
הרקע autofluorescence של דגימות ביולוגיות לעיתים קרובות מסבך מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית טכניקות הדמיה, במיוחד ברקמות בגילאי postmitotic האנושית. פרוטוקול זה מתאר איך autofluorescence מן הדגימות ניתן להסיר ביעילות באמצעות אור זמינים מסחרית פליטת אור דיודה המקור photobleach המדגם לפני immunostaining.
Abstract
Immunofluorescence היא שיטה נפוצה כדי להמחיש תאים subcellular וכדי לקבוע הלוקליזציה של חלבונים ספציפיים בתוך דגימת רקמה. מכשול גדול כדי הרכישה של תמונות באיכות גבוהה immunofluorescence הוא autofluorescence אנדוגני של הרקמה שנגרם על ידי פיגמנטים הזדקנות כגון lipofuscin או תהליכים הכנה מדגם נפוצים כגון קיבוע אלדהיד. פרוטוקול זה מתאר כיצד רקע זריחה יכול להיות הקטנו דרך photobleaching באמצעות אור זרחן לבן פולטות נורית led מערכים לפני הטיפול עם הגששים פלורסנט. רחבת ספקטרום הפליטה של זרחן לבן נוריות לאפשר הלבנת של fluorophores על פני טווח של פליטת פסגות. המנגנון photobleaching יכול להיות בנוי רכיבים מדף במחיר נמוך מאוד, ומציע אלטרנטיבה נגיש זמין מסחרית quenchers כימי. טיפול קדם photobleaching של הרקמה ואחריו immunofluorescence המקובלת מכתים יוצר תמונות חינם של הרקע autofluorescence. בהשוואה ל הוקמה quenchers כימיים אשר מופחת בדיקה, כמו גם רקע אותות, טיפול photobleaching לא היתה השפעה על עוצמת קרינה פלואורסצנטית בדיקה בעוד הוא ביעילות מופחת קרינה פלואורסצנטית הרקע ואת lipofuscin. למרות photobleaching דורשת יותר זמן לטיפול מראש, מערכים LED בעוצמה גבוהה יותר עשוי לשמש כדי לצמצם את זמן photobleaching. ניתן להחיל שיטה פשוטה זו פוטנציאל למגוון של רקמות, במיוחד postmitotic הרקמות שנצברים lipofuscin כמו המוח והשרירים לב או השלד.
Introduction
קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ באמצעות נוגדנים מיקוד חלבונים ספציפיים משמש באופן שגרתי כדי להמחיש חלבונים עניין בתרבית תאים ורקמות. סיבוך הגדולות רכישת תמונות ברורה ומוחלטת ב- immunofluorescence הוא autofluorescence, אשר יכולה להיגרם endogenously בתרבית של רקמה על ידי lipofuscin פיגמנט של הגיל על ידי חלבונים כגון אלסטין וקולגן1, 2. יכול להיות הציג את מקורות אחרים של autofluorescence הצעדים הכנה מדגם כגון אלדהיד קיבוע3. Lipofuscin בגרגרים, המורכבת בעיקר חלבון oxidatively שונה, השומנים השפלה ומשקעים, להצטבר בתאים חיים ארוך עם גיל מוגבר2. גורם לקשיים הדמיה postmitotic רקמות כגון את המוח ואת הלב או השלד השרירים, כפי ספקטרום הפליטה זריחה של lipofuscin הינו רחב ומשתנה, לעיתים קרובות בד בבד עם אורך הגל פליטה של fluorophores נפוץ המשמש תיוג4. גורמים אלה לבצע הדמיה של רקמת המוח האנושי מפני מקרים של מחלות ניווניות בגיל מאוחר כמו ניוון frontotemporal אוני (FTLD) מאתגר במיוחד.
כדי לצמצם את autofluorescence, אנחנו המציאו טכניקה שבה אנחנו להאיר הסעיפים רקמות רכוב שקופיות עם אור לבן פולטות מערך דיודות (LED) באמצעות מנורת שולחן ביתי5. טכניקה פשוטה זו מספקת אלטרנטיבה טכניקות שמשתמשות quenchers כימיים כגון CuSO4 אמוניום אצטט, או זמינים מסחרית שכבתה צבעי כגון סודאן שחור B ו- T שחורה Eriochrome6. יש לו גם יותר חסכוניים משמעותית מולטי ספקטריאליות הוביל המנורה photobleaching טכניקות ומונע סיבוכים וחפצי המופקים autofluorescence דיגיטלי שיטות להסרת כמו ספקטרלי ערבוב האו ם7,8. זרחן לבן נוריות יש ספקטרום פליטה רחבה, עוצמת אור גבוהה עלות הייצור נמוך, הפיכתם ומהווה מרכיב מדף עבור photobleaching מגוון הן5,9.
פרוטוקול זה, אנחנו מדגימים הקמת מנגנון photobleaching באמצעות רכיבי נגיש, photobleaching חלות על מקרה של רקמות FTLD המכיל הכללות טאו-חיוביות (FTLD-T) באמצעות של נוגדנים ספציפיים טאו phosphorylated. נדגים את השפעת photobleaching על הדמיה נוגדנים fluorescently התווית על-ידי העסקת שתי הנפוצות הן: אלקסה 488 ואדום טקסס. ההשפעה של photobleaching לעומת סעיפים שלא טופלו או כאלה שטופלו כ’חטיף כימי מסחרי לכמת, בהשוואה. טיפול קדם זה photobleaching שניתן לשלבן בכל פרוטוקול מוכתמים immunofluorescence סטנדרטי להסרת autofluorescence דגימה ביולוגית.
Protocol
Representative Results
Discussion
הטיפול מראש photobleaching של רקמות תיאר כתב יד זה מאפשר לחיסול יעיל של autofluorescence באמצעות רכיבי מדף. הפרוטוקול מתאר immunofluorescence הדמיה של טאו phosphorylated אגרגטים ברקמת המוח האנושי פורמלין-קבוע באמצעות נוגדנים משניים מצומדת 488 אלקסה, רד טקסס, עם דאפי כמו גרעיני counterstain. כדי להחיל את השיטה על רקמות אחרות, אנ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך באופן מלא או באופן חלקי על ידי הקנדי קונסורציום של הקשורים ניוון מוחיים הזדקנות (CCNA), המכון הקנדי של הבריאות מחקר (CIHR), החברה ALS של קנדה (ALS קנדה) והחברה האלצהיימר של קנדה (ASC). המחברים רוצה להודות סולטן Darvesh, אנדרו ריד מהבנק הימי במוח רקמות למתן הרקמות במוח FTLD, מילאנו גנגולי מן התוכנית מיקוד-עתיים, הגברה של קרינה התגובה (STTARR) ובאמצעות שלה מימון לסוכנויות רקמות הטבעה ואת חלוקתה, וכן את מתקדמת אופטי מיקרוסקופ מתקן (AOMF) על מתן כלים מיקרוסקופ. קווין האדלי. הוא הודה על סקירה ביקורתית של כתב היד.
Materials
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Sodium Choloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Hydrochloric Acid | Caledon Laboratory Chemicals | 1506656 | |
| Sodium Azide | BioShop Canada | SAZ001 | |
| 100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish | Sarstedt | 82.9923.422 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| 6 W LED Dimmable Desk Lamp | DBPower | DS501 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| Citric Acid | Sigma-Aldrich | C-2404 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop Canada | EDT001 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| Sodium Hydroxide | BioShop Canada | SHY700.1 | |
| Water bath | Haake Fisons | K15 | |
| Slide collector | FisherScientific | 12-587-17B | |
| Staining Jar | FisherScientific | E94 | |
| Orbital Shaker | Bellco Glass | 7744-08115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T7878 | |
| Bovine Serum Albumin | FisherScientific | BP1600-1 | |
| Normal Goat Serum | Aurion | 905.002 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z672548-1EA | |
| Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8) | ThermoFisher | MN1020 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X | ThermoFisher | T862 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-11029 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | ThermoScientific | 28-600-42 | |
| Glass soverslip | |||
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | |
| Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0 | Zeiss | LSM710 | Software accompanies the Confocal Microscope |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| RGB Profile Tools macro | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt | |
| Commercial chemical quencher | Biotum | 23007 |
References
- Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. J Investig Med. 47 (6), 326-332 (1999).
- Terman, A., Brunk, U. T. Lipofuscin . Int J Biochem Cell Biol. 36 (8), 1400-1404 (2004).
- Del Castillo, P., Llorente, A. R., Stockert, J. C. Influence of fixation, exciting light and section thickness on the primary fluorescence of samples for microfluorometric analysis. Basic Appl Histochem. 33 (3), 251-257 (1989).
- Ottis, P., Koppe, K., et al. Human and rat brain lipofuscin proteome. Proteomics. 12 (15-16), 2445-2454 (2012).
- Sun, Y., Chakrabartty, A. Cost-effective elimination of lipofuscin fluorescence from formalin-fixed brain tissue by white phosphor light emitting diode array. Biochem Cell Biol. 94 (6), 545-550 (2016).
- Davis, A. S., Richter, A., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Pepperkok, R. Spectral imaging and its applications in live cell microscopy. FEBS Lett. 546 (1), 87-92 (2003).
- Duong, H., Han, M. A multispectral LED array for the reduction of background autofluorescence in brain tissue. J Neurosci Methods. 220 (1), 46-54 (2013).
- Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS One. 3 (5), 1-7 (2008).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Robertson, J. B., Zhang, Y., Johnson, C. H. Light-emitting diode flashlights as effective and inexpensive light sources for fluorescence microscopy. J Microsc. 236 (1), 1-4 (2009).
- Mackenzie, I. R. A., Neumann, M. Molecular neuropathology of frontotemporal dementia: insights into disease mechanisms from postmortem studies. J Neurochem. 138 (S1), 54-70 (2016).
- Kouri, N., Whitwell, J. L., Josephs, K. A., Rademakers, R., Dickson, D. W. Corticobasal degeneration: a pathologically distinct 4R tauopathy. Nat Rev Neurol. 7 (5), 263-272 (2011).
