بروتوكول لتجميع المرحلة الصلبة من أوليغوميرس من الحمض النووي الريبي تحتوي على 2'-<em> O</em> -thiofenylmethyl تعديل وتوصيف عن طريق التعميم ديكرويسم
Summary
توفر هذه المقالة إجراء مفصل على التوليف المرحلة الصلبة، وتنقية، وتوصيف دوديكامرز من الحمض النووي الريبي تعديلها في C2'- O -position. وتستخدم الأشعة فوق البنفسجية والدائرية تحلل ضوئي اللون الضوئية لتحديد وتوصيف الجوانب الهيكلية، أي أحادية أو خيوط مزدوجة.
Abstract
وقد تم استخدام توليف المرحلة الصلبة للحصول على البوليمرات الكنسي والمعدلة من الأحماض النووية، وتحديدا من الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي، مما جعلها منهجية شعبية للتطبيقات في مختلف المجالات ولأغراض بحثية مختلفة. ويركز الإجراء الموصوف هنا على تخليق وتنقية وتوصيف دوديكامرز من الحمض النووي الريبي 5 '- [كوا كغغ أو كاو] -3' تحتوي على صفر، واحد، أو اثنين من التعديلات الموجودة في C2'- O- وضع. وتستند تحقيقات مجموعات 2-ثيوفينيل ميثيل، دمجها في النيوكليوتيدات رنا عن طريق التوليف العضوي القياسية وأدخلت في أوليغونوكلأوتيدس المقابلة عبر الفوسفوراميديت منها. يستعمل هذا التقرير كيمياء الفوسفوراميديت من خلال القواعد النووية الأساسية الأربعة (أوريدين (U)، سايتوسين (C)، غوانوسين (G)، أدينوسين (A))، فضلا عن النيوكليوتيدات 2-ثيوفينيل ميثيل فونكتيوناليزد تعديل في 2'- O- موضع؛ ومع ذلك، فإن منهجية قابلة للفارق كبيرآية من التعديلات التي تم تطويرها على مر السنين. تم تصنيع أوليغونوكلأوتيدس على دعم الزجاج المسام (كبغ) تليها الانقسام من الراتنج و ديبروتكتيون في ظل ظروف قياسية، أي خليط من الأمونيا وميثيل أمين (أما) تليها فلوريد الهيدروجين / ثلاثي إيثيل أمين / N- ميثيل بيروليدينون. تم تنقية أوليغونوكلأوتيدس المقابلة من خلال الكهربائي الكهربائي بولي أكريلاميد (20٪ تغيير طبيعة) تليها شطف، تحلية، والعزلة عبر كروماتوغرافي المرحلة عكس (سيب-باك، C 18 عمود). تم تقييم الكمي والبارامترات الهيكلية من خلال تحليل الأشعة فوق البنفسجية المرئية (أوف-فيس) والتحليل الضوئي ثنائي الأبعاد (سد) على التوالي. ويهدف هذا التقرير ليكون بمثابة مصدر ودليل للباحثين المبتدئين والخبراء المهتمين في الشروع في هذا المجال. ومن المتوقع أن تكون بمثابة عمل جار مع تطوير تكنولوجيات ومنهجيات جديدة. وصف المنهجيات والتقنيات داخل ثيق تتوافق مع المزج دنا / رنا (تجديدها وشرائها في عام 2013) الذي يستخدم الكيمياء الفوسفوراميديت.
Introduction
التوليف المرحلة الصلبة للحصول على أوليغونوكلأوتيدس من الحمض النووي / رنا هو أداة قوية التي خدمت العديد من التطبيقات في مختلف المجالات منذ 1970s 1 ، 2 ، 3 باستخدام اللبنات الفوسفوراميديت 4 . وتشمل الأمثلة على تأثيره الواسع ما يلي: تأثيره في وضع العلامات ( عن طريق تفاعلات الكيمياء النقية) 5 ، والتحقيق الهيكلي 6 ، والتكنولوجيات المضادة للعوامل 7 ، فضلا عن توضيح الآليات البيولوجية 8 و 9 والمصدر كمادة جينية 10 ، ودراسة مختلف التعديلات الطبيعية و / أو الكيميائية 11 ، 12 ، من بين العديد من الآخرين.التعديل الذي نستخدمه هنا يمثل الخطوة الأولى في جهودنا للحصول على أوليغونوكلأوتيدس الحمض النووي الريبي التي تحتوي علىتحقيقات فوتواكتيف لتمكين السيطرة الزمنية لهيكل ووظيفة هذا البوليمر الحيوي المهم.
تركيب دوديكامرات الحمض النووي الريبي مع تسلسل: 5 '- [كوا سغ G A أو كاو] -3' / 5 '- [أوج أو كغ واغ] -3' (تمثل المواقف تحتها خط إدراج تعديل C2'- O- ثيوفينيل ميثيل ) تشكل محور هذه الدراسة. تم اختيار تسلسل لتمكين القياس الكمي وقياس خيوط الحمض النووي الريبي كخيط واحد، أو على شكل الهياكل المزدوجة المقابلة لها (لم يتم توقع أي هياكل ثانوية أخرى مستقرة ثيرموديناميكيا). وقد استخدم القرص المضغوط لتحديد البارامترات الهيكلية، أي التشكيل المزدوج والتحولات الحرارية.
نتيجة الجمع بين الطريحة والنقيضة
الإجراء العام للحصول على هذه أوليغونوكلأوتيدس هو موضح في الشكل 1 ويتبع عملية متدرجة: الآلي الصلبة مرحلة التوليف → ديبرأوتكتيون → تنقية → الكمي → توصيف. الشكل 2 يعرض وحدات أحادية ضرورية في هذا الإجراء. تركيب المرحلة الصلبة من الحمض النووي الريبي مشابه لتلك التي من الحمض النووي في أنه يقوم على الكيمياء الفوسفوراميديت ( الشكل 2 ، اليسار) واستخدام مجموعات حماية قاعدة عاملة للأمينات الحلقي نيوكليوفيليك على G و A و C، على سبيل المثال ، أسيتيل، بنزويل، فينوكسياستيل، t- البوتيل أو N ، N- ثنائي ميثيل فورماميد ( الشكل 2 ، والحق). ومن الجوانب الأخرى التي يجب مراعاتها في الحمض النووي الريبي (رنا)، بسبب وجود مجموعة C2'-أوه (التي تفتقر إلى البوليمرات الحيوية ديوكسيوليغونوكليوتيد)، هي الخطوة الإضافية التي يجب إدراجها لحماية هذا الوضع النوكليوفيلي، وما يتبعه من حماية. في هذا الصدد، أصبحت مجموعات الحماية القائمة على السيليكون استراتيجية جذابة نظرا لقدراتها كما شذوذ بيورثوغونال (سبيسيفيكالdeprotected ذ في وجود الفلورايد)، مع -butyldimethylsilyl ثالثي (TBDMS) والجماعات triisopropylsilyloxymethyl (TOM) كخيارات شعبية (الشكل 2، أسفل اليسار).
في هذا العمل، تم إجراء التوليف الآلي على المزج الحمض النووي / الحمض النووي الريبي الذي يستخدم الكيمياء الفوسفوراميديت القياسية. وتشمل إعدادات المصنع على الصك خطوة التخفيف الآلي عند استخدام الإصدارات التجارية من الفوسفوراميديتس للحمض النووي، أو خيار لتخفيف في وحدات التخزين التي يحددها المستخدم. ومع ذلك، قررنا أن تزن الفوسفوراميديت الحمض النووي الريبي وتمييع يدويا نظرا لما يلي: 1) سعر الفوسفوراميديتس الكنسي من الحمض النووي الريبي هو أعلى (تصل إلى 50 مرات أكثر تكلفة في بعض الحالات). 2) غالبا ما يتم الحصول على الفوسفوراميديت المعدلة بكميات صغيرة. و 3) كمية المواد المهدرة عند استخدام خطوة التخفيف الآلي (التي وضعتها الشركة المصنعة) كبيرة. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمنا: 1) المتاحة تجاريا الصلبة الدعم(على سبيل المثال ، كبغ) تحتوي على نوكليوباس المحمية لتكون بمثابة 3'نهاية. و 2) الفوسفوراميديتس التجارية (نوكليوباسيس الكنسي) محمية مع مجموعة تبدمس في C2'- O- الوضع. وترد قائمة مفصلة من خطوات التوليف في الشكل 3 والجدول 1 ، جنبا إلى جنب مع مزيد من الوصف والتعليقات للخطوات التي تم تعديلها لتوليف الحمض النووي الريبي. وعلاوة على ذلك، يوضح الشكل 4 غلة تدريجي التي لوحظت في كل خطوة بعد اختيار الخيار "تريتيل مراقب"، الذي كوانتيتاتس كاتيون تيتيل صدر من كل خطوة ديتريتيلاتيون.
ومن الجدير بالذكر أن عادة، في تجربتنا، وكان العامل المحدد الحصول على الفوسفوراميديت تحتوي على التعديل المطلوب. وهذا هو، وضع منهجية الاصطناعية التي تسمح لإدراج التعديلات في مواقع مختارة. في هذا التقرير، ونحن نركز علىدمج النيوكليوتيدات المعدلة التي أنشأنا المنهجية الاصطناعية المقابلة، ومجموعة C2'- O- ثيوفينيل ميثيل. هذه المجموعة صغيرة الحجم ولا تؤثر على تركيب المرحلة الصلبة بأي شكل من الأشكال. منذ إدراج هذه المجموعة في أوليغونوكلأوتيدس من الحمض النووي الريبي تم الإبلاغ، جنبا إلى جنب مع المعلمات الهيكلية والثيرموديناميكية 4 ، لن يتم وصف أي جوانب من التوليف العضوي يؤدي إلى الفوسفوراميديتس المعدلة هنا.
ديبروتكتيون، تنقية، والتوصيف
يحدث ديبروتكتيون من الأمينات إكسوسيكليك ومجموعات سي-سيانويثيل في نفس الخطوة التي انشقاق من كبغ الراتنج. طبقنا الشروط المستخدمة عادة لتسخين الراتنج التي تم الحصول عليها في وجود محلول مائي من أما، تليها انشقاق مجموعات C2'- O- سيليل في وجود أيونات الفلوريد، ومن ثم تنقية عن طريق هلامالكهربائي. في حين أن هذه قد أصبحت شروطا قياسية في كثير من الحالات، تعديلات قد تكون مؤهلة للظروف الأساسية أو أيونات الفلوريد قد تتطلب ظروف أكثر اعتدالا 13 ، 14 ، على سبيل المثال ، الميثانول / كربونات البوتاسيوم (ميوه / K 2 كو 3 )، أو بوتيلامين. وبالتالي، مجموعة مختلفة من مجموعات حماية على فسفوراميديتس المقابلة أمر ضروري. وعلاوة على ذلك، اخترنا الكهربائي كبديل مفضل لتنقية أوليغوميرس ديبروتكتد نظرا لتجربتنا السابقة مع هذه الطريقة وعدم وجود أجهزة أخرى. ومع ذلك، يمكن أن تستخدم هبلك بدلا من ذلك كوسيلة فعالة 15 . تم توصيف أوليغونوكلأوتيدس المنقى من خلال مطياف الكتلة، مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز / التأين الوقت الرحلة (مالدي-توف)، وذلك باستخدام الإجراء المبلغ عنه من قبل مجموعتنا 16 .
التوصيف الهيكلي و تم إجراء الاستقرار المالي للدوبلكس التي تم الحصول عليها عن طريق سد. على وجه التحديد، ونحن الاستفادة من سد لتحديد التحولات تمسخ الحرارية من أوليغونوكلأوتيدس المعدلة وغير المعدلة من الحمض النووي الريبي عن طريق اتباع الانخفاض في إهليلجية الفرقة في كاليفورنيا. 270 نانومتر، فضلا عن اختفاء الفرقة (مع إهليلجية سلبية) مع λ كحد أقصى في 210 نانومتر. يتم توفير مقارنة الطيف قبل وبعد التهجين لتوضيح الاختلافات وتوفير التحقق من المنهجية المستخدمة. استخدام سد هو مقبول على نطاق واسع في تحديد الزخارف الهيكلية في الأحماض النووية و أمينواسيدس 17 ، وبالتالي يمكن استخدامها كأداة لتحديد مختلف المعلمات الهيكلية والحرارية الديناميكية 18 ؛ ومع ذلك، ليست هناك أمثلة كثيرة حيث يتم استخدام تقنية لتقييم التحولات الحرارية تمسخ. وتشمل بعض الحالات تحديد الثباتات الحرارية على الحمض النووي الذي يحتوي على G-كوادروبلكسسأس = "كريف"> 19 ، 20 أو في الدوبلكس ودبابيس رنا 21 .
ويهدف هذا التقرير إلى تزويد القارئ أو المشاهد غير الخبير بمجموعة من الأدوات التي تمكن من البدء بسلاسة في هذا النوع من البحوث. وسوف تعمل على تعزيز ومقارنتها مع المنهجيات والتقنيات في مختبرات البحوث الأخرى التي تشارك في هذا الفرع مثيرة من العلم. المحتوى في هذا التقرير يضيف إلى البروتوكولات الحالية من هذه التكنولوجيا من مصادر مختلفة، ويثري ويسهل تجربة مع المعونة البصرية لكل خطوة.
Protocol
Representative Results
Discussion
القصد من هذه المخطوطة هو أن تكون بمثابة دليل للباحثين في الميدان، مبتدئا أو خبير، لتحقيق بنجاح أو تعزيز تخليق قليل النوكليوتيدات من الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي. وتركز منهجية وصفها على استخدام التوليف المرحلة الصلبة باستخدام المزج الآلي / الحمض النووي الريبي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم إعداد هذه المخطوطة من خلال الأموال المبتدئة من جامعة كولورادو دنفر (جمر). أف ترغب في الاعتراف بدعم من البحوث والأنشطة الإبداعية جائزة (ركاس، سو دنفر). وتم الإقرار بتمويل من مكتب خدمات البحوث بجامعة كولورادو دنفر لتغطية رسوم النشر. نود أن نشكر أعضاء المختبر السيدة كاساندرا هربرت والسيد يانيك K. دزوو لمساهماتهم في جزء الفيديو.
Materials
| AbsolveTM | PerkinElmer | 6NE9711 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC Grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Acetonitrile 99.9%, anhydrous for DNA sequencing | Fisher BioReagents | 75-05-8 | |
| Acrylamide, 99+% | ACROS Organics | 164850025 | |
| Ammonium chloride 98+% | Alfa Aesar | 12125-02-9 | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Ammonium hydroxide 28-30% in water, ACS Plus | Fisher Chemical | 1336-21-6 | |
| Ammonium persulfate | ACROS Organics | 1444 | |
| Argon-ultra high purity | Airgas | 7440-37-1 | |
| Bis-acrylamide Ultra pure | VWR-Amresco | 172 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A73-1 | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Ethanol, anhydrous, histological grade | Fisher Chemical | 64-17-5 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dehydrate 100.2% | Fisher Chemical | 6381-92-6 | |
| Formamide | Thermo Scientific | 75-12-7 | |
| Hydrochloric acid, 36.5-38.0%, Certified ACS Plus | Fisher Chemical | 7647-01-0 | |
| Magnesium chloride hexahydrate, 99% | Fisher Scientific | 7786-30-3 | |
| Methanol, 99.9%, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Methylamine 40% in water | Sigma Aldrich | 74-89-5 | |
| 1-Methyl-2-pyrrolidinone, andhydrous, 99.5% | Aldrich | 872-50-4 | |
| Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm) | MDS SCIEX | 1020157 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| Sodium acetate, anhydrous 99.2%, Certified ACS | Fisher Chemical | 127-09-3 | |
| Sodium chloride, 100.5%, Certified ACS | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate 99.0% | Sigma | 13472-35-0 | |
| 2’,4’ Triethylamine, 99+% | Alfa Aesar | 121-44-8 | |
| TEMED | Amresco | 761 | |
| Triethylamine trihydrofluoride, 98% | Aldrich | 73602-61-6 | |
| Trifluoroacetic acid, 99% | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP154-3 | |
| Urea | Fisher Scientific | U15-3 | |
| Reagents for the RNA synthesis: | |||
| Deblocking mix, 3% trichloroacetic acid in dichloromethane | Glen Research | 40-4140-57 | |
| Cap Mix A, THF/Pyridine/Acetic anhydride | Glen Research | 40-4110-52 | |
| Cap Mix B, 10% 1-methylimidazole in THF | Glen Research | 40-4120-52 | |
| Activator, 0.25 M 5-ethylthio-1H-tetrazole in anhydrous acetonitrile | Glen Research | 30-3140-52 | |
| Oxidizing Solution, 0.02 M iodine in THF/Pyridine/Water | Glen Research | 40-4330-52 | |
| U-RNA-CPG | Glen Research | 20-3330-xx | |
| Ac-G-RNA-CPG | Glen Research | 20-3324-xx | |
| Ac-G-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3025-xx | |
| U-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3030-xx | |
| Ac-C-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3015-xx | |
| Bz-A-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3003-xx |
References
- Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. The synthesis of oligodeoxypyrimidines on a polymer support. Tetrahedron Lett. 21 (8), 719-722 (1980).
- Beaucage, S. L., Caruthers, M. H. Deoxynucleoside phosphoramidites-A new class of key intermediates for deoxypolynucleotides. Tetrahedron Lett. 22 (20), 1859-1862 (1981).
- Caruthers, M. H. Gene synthesis machines: DNA Chemistry and its uses. Science. 230 (4723), 281-285 (1985).
- Nguyen, J. C., et al. Synthesis, Thermal Stability, Biophysical Properties, and Molecular Modeling of Oligonucleotides of RNA Containing 2′-O-2-Thiophenylmethyl Groups. J Org Chem. 81 (19), 8947-8958 (2016).
- El-Sagheer, A. H., Brown, T. Click chemistry with DNA. Chem Soc Rev. 39, 1388-1405 (2010).
- Puffer, B., et al. 5-Fluoro pyrimidines: labels to probe DNA and RNA secondary structures by 1D 19F NMR spectroscopy. Nucleic Acids Res. 37 (22), 7728-7740 (2009).
- Wan, W. B., Seth, P. P. The medicinal chemistry of therapeutic oligonucleotides. J Med Chem. 59 (21), 9645-9667 (2016).
- Zhou, C., Greenberg, M. M. DNA Damage by histone radicals in nucleosome core particles. J Am Chem Soc. 136 (18), 6562-6565 (2014).
- Zhang, Y., et al. UV-Induced proton-coupled electron transfer in cyclic DNA miniduplexes. J Am Chem Soc. 138 (23), 7395-7401 (2016).
- Anosova, I., et al. The structural diversity of artificial genetic polymers. Nucleic Acids Res. 44 (3), 1007-1021 (2016).
- Riml, C., Micura, R. Synthesis of 5-Hydroxymethylcytidine- and 5-Hydroxymethyl-uridine-Modified RNA. Synthesis. 48, 1108-1116 (2016).
- Anderson, B. A., Hrdlicka, P. J. Merging Two Strategies for Mixed-Sequence Recognition of Double-Stranded DNA: Pseudocomplementary Invader Probes. J Org Chem. 81 (8), 3335-3346 (2016).
- Beaucage, S. L., Iyer, R. P. Synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach. Tetrahedron. 48 (12), 2223-2311 (1992).
- Gillet, L. C. J., Alzeer, J., Schärer, O. D. Site-specific incorporation of N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-acetylaminofluorene (dG-AAF) into oligonucleotides using modified ‘ultra-mild’ DNA synthesis. Nucleic Acids Res. 33 (6), 1961-1969 (2005).
- Shiba, Y., et al. Chemical synthesis of a very long oligoribonucleotide with 2-cyanoethoxymethyl (CEM) as the 2′-O.-protecting group: structural identification and biological activity of a synthetic 110mer precursor-microRNA candidate. Nucleic Acids Res. 35 (10), 3287-3296 (2007).
- Choi, Y. J., Gibala, K. S., Ayele, T., Deventer, K. D., Resendiz, M. J. E. Biophysical properties, thermal stability and functional impact of 8-oxo-7,8-dihydroguanine on oligonucleotides of RNA – a study of duplex, hairpins and the aptamer for preQ1 as models. Nucleic Acids Res. 45 (4), 2099-2111 (2017).
- Ranjbar, B., Gill, P. Circular dichroism techniques: Biomolecular and nanostructural analyses – A review. Chem Biol Drug Des. 74 (2), 101-120 (2009).
- Mergny, J. -. L., Lacroix, L. Analysis of thermal melting curves. Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).
- Jin, R., Breslauer, K. J., Jones, R. A., Gaffney, B. L. Tetraplex formation of a guanine-containing nonameric DNA fragment. Science. 250 (4980), 543-546 (1990).
- Virgilio, A., et al. 5-Hydroxymethyl-2′-deoxyuridine residues in the thrombin binding aptamer: Investigating anticoagulant activity by making a tiny chemical modification. CHEMBIOCHEM. 15 (16), 2427-2434 (2014).
- Chauca-Diaz, A. M., Choi, Y. J., Resendiz, M. J. E. Biophysical properties and thermal stability of oligonucleotides of RNA containing 7,8-dihydro-8-hydroxyadenosine. Biopolymers. 103 (3), 167-174 (2015).
- Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. 14, 173-185 (1987).
- Markham, N. R., Zuker, M. UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization. Methods Mol Biol. 453, 3-31 (2008).
- Breslow, R., Huang, D. -. L. Effects of metal ions including Mg2+ and lanthanides on the cleavage of ribonucleotides and RNA model compounds. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (10), 4080-4083 (1991).
- Blumberg, D. D. Creating a ribonuclease-free environment. Methods Enzymol. 152 (2), 20-24 (1987).
- AbouHaidar, M. G., Ivanov, I. G. Non-enzymatic RNA promoted by the combined catalytic activity of buffers and magnesium ions. Z Naturforsch C. 54 (7-8), 542-548 (1999).
- Farrell, R. E. . RNA Methodologies (4th Ed): A laboratory guide for isolation and characterization. 2, 45-80 (2010).
