Protocolo para síntese de fase sólida de oligómeros de ARN contendo um 2'-<em> O</em> -tiofenilmetilo Modificação e Caracterização através do Dicroísmo Circular
Summary
Este artigo fornece um procedimento detalhado sobre a síntese em fase sólida, a purificação e a caracterização de dodecamers de ARN modificados na posição C2'- O . As análises fotométricas UV-vis e dicroísmo circular são usadas para quantificar e caracterizar aspectos estruturais, ou seja , de uma única linha ou de duas vertentes.
Abstract
A síntese em fase sólida tem sido utilizada para obter polímeros canônicos e modificados de ácidos nucleicos, especificamente de DNA ou RNA, o que tornou uma metodologia popular para aplicações em vários campos e para diferentes fins de pesquisa. O procedimento aqui descrito concentra-se na síntese, purificação e caracterização de dodecamers de RNA 5 '- [CUA CGG AAU CAU] -3' contendo zero, uma ou duas modificações localizadas na posição C2'- O . As sondas são baseadas em grupos 2-tiofenilmetilo, incorporados em nucleótidos de ARN através de síntese orgânica padrão e introduzidos nos oligonucleótidos correspondentes através dos seus respectivos fosforamiditos. Este relatório faz uso da química da fosforamidita através das quatro nucleobases canônicas (Uridina (U), Citosina (C), Guanosina (G), Adenosina (A)), bem como nucleotídeos funcionalizados com 2-tiofenilmetilo modificados no 2'- O- posição; No entanto, a metodologia é favorável para uma grande variedadeMuitas modificações que foram desenvolvidas ao longo dos anos. Os oligonucleótidos foram sintetizados em um suporte de vidro de poro controlado (CPG) seguido por clivagem da resina e desprotecção em condições padrão, isto é , uma mistura de amônia e metilamina (AMA) seguida de fluoreto de hidrogênio / trietilamina / N-metilpirrolidinona. Os oligonucleótidos correspondentes foram purificados por meio de eletroforese de poliacrilamida (20% de desnaturação) seguido por eluição, dessalinização e isolamento através de cromatografia de fase reversa (Sep-pak, coluna C18 ). A quantificação e os parâmetros estruturais foram avaliados através de análise fotométrica de dicroísmo circular (CD-UV) visível ultravioleta (UV-vis), respectivamente. Este relatório pretende servir como um recurso e guia para iniciantes e especialistas pesquisadores interessados em embarcar neste campo. Espera-se que sirva como um trabalho em andamento à medida que novas tecnologias e metodologias são desenvolvidas. A descrição das metodologias e técnicas dentroO documento da S corresponde a um sintetizador de DNA / RNA (remodelado e comprado em 2013) que utiliza química de fosforamidite.
Introduction
A síntese em fase sólida para obter oligonucleótidos de DNA / RNA é uma ferramenta poderosa que serviu várias aplicações em vários campos desde a década de 1970 1 , 2 , 3 usando blocos de construção de fosforamidita 4 . Exemplos de sua ampla influência incluem: seu impacto na rotulagem ( através de reações de química de clique) 5 , sondagem estrutural 6 e tecnologias anti-sentido 7 , bem como a elucidação de mecanismos biológicos 8 , 9 , fonte como material genético 10 e o estudo de Várias modificações naturais e / ou químicas 11 , 12 , entre muitos outros. A modificação que usamos aqui representa o primeiro passo em nossos esforços para obter oligonucleótidos de RNA que contenhamSondas fotoativas para permitir o controle temporal da estrutura e função deste importante biopolímero.
A síntese de dodecamers de ARN com sequências: 5 '- [CUA CG G A UA CAU] -3' / 5 '- [agosto AUU CCG UAG] -3' (posições sublinhadas representam a incorporação de uma modificação -thiophenylmethyl C2'- ó ) Constitui o foco deste estudo. As seqüências foram escolhidas para permitir a quantificação e medição de fios de ARN como fios simples, ou como suas estruturas duplex correspondentes (nenhuma outra estrutura secundária foi prevista como termodinamicamente estável). O CD foi utilizado para estabelecer os parâmetros estruturais, ou seja , a formação do duplex e as transições de desnaturação térmica.
Síntese
O procedimento geral para a obtenção destes oligonucleótidos é ilustrado na Figura 1 e segue o processo passo a passo: Síntese de fase sólida automatizada → DeprOteção → Purificação → Quantificação → Caracterização. A Figura 2 mostra as unidades monoméricas que são necessárias neste procedimento. A síntese em fase sólida do RNA é semelhante à do DNA, na medida em que se baseia na química da fosforamidite ( Figura 2 , à esquerda) e na utilização de grupos protectores base-labileis para as aminas exocíclicas nucleófilas em G, A e C, eg , Acetilo, benzoílo, fenoxiacetilo, t- butilo ou N , N- dimetilformamida ( Figura 2 , à direita). Mais um aspecto a considerar no RNA, devido à presença do grupo C2'-OH (faltando nos biopolímeros desoxioligonucleotídicos), é o passo adicional que deve ser incorporado para proteção e posterior desproteção desta posição nucleofílica. A este respeito, os grupos de proteção baseados em silício tornaram-se uma estratégia atraente devido ao seu potencial como porções biortogonais (especificamenteE desprotegido na presença de fluoreto), com os grupos terc- butildimetilsililo (TBDMS) e triisopropilsililoximetilo (TOM) como escolhas populares ( Figura 2 , inferior esquerda).
Neste trabalho, a síntese automatizada foi realizada em um sintetizador de DNA / RNA que usa química padrão de fosforamidite. As configurações do fabricante no instrumento incluem um passo de diluição automatizado ao usar as versões comerciais dos fosforamiditos para o DNA ou a opção de diluir nos volumes configurados pelo usuário. No entanto, decidimos pesar o ARN fosforamidito e diluir manualmente, dado que: 1) o preço dos fosforamiditos canônicos do RNA é maior (até 50 vezes mais caro em alguns casos); 2) os fosforamiditos modificados são frequentemente obtidos em pequenas quantidades; E 3) a quantidade de material desperdiçado após o uso de um passo de diluição automatizado (definido pelo fabricante) é grande. Além disso, utilizamos: 1) suportes sólidos comercialmente disponíveis(Por exemplo , CPG) contendo uma nucleobase protegida para funcionar como a extremidade 3 '; E 2) fosforamiditos comerciais (nucleobases canônicas) protegidos com um grupo TBDMS na posição C2'- O . A lista detalhada dos passos de síntese é fornecida na Figura 3 e Tabela 1 , juntamente com descrição e comentários adicionais para etapas que foram ajustadas para a síntese de RNA. Além disso, a Figura 4 ilustra os rendimentos passo a passo que são observados para cada passo depois de selecionar a opção 'Trityl Monitor', que quantifica o catião tritil que é liberado de cada passo de detrilação.
Vale ressaltar que tipicamente, em nossa experiência, o fator limitante foi a obtenção da fosforamidita contendo a modificação desejada. Ou seja, o desenvolvimento de uma metodologia sintética que permite a incorporação de modificações em sites selecionados. Neste relatório, nos concentramos naIncorporação de um nucleótido modificado para o qual estabelecemos a metodologia sintética correspondente, o grupo C2'- O- tiofenilmetilo. Este grupo é de tamanho pequeno e não afeta a síntese em fase sólida de qualquer maneira. Uma vez que a incorporação deste grupo em oligonucleótidos de ARN foi relatada, juntamente com os parâmetros estruturais e termodinâmicos 4 , não serão descritos aqui os aspectos de síntese orgânica que levem aos fosforamiditos modificados.
Desproteção, Purificação e Caracterização
A desprotecção das aminas exocíclicas e dos grupos ß-cianoetilo ocorre no mesmo passo que a da clivagem da resina CPG. Aplicamos as condições comumente usadas para aquecer a resina obtida na presença de uma solução aquosa de AMA, seguida por clivagem dos grupos C2'- O- sililo na presença de iões fluoreto e depois purificação através de gelEletroforese. Embora estes tenham se tornado condições padrão em muitos casos, modificações que são lábiles para condições básicas ou íons fluoreto podem exigir condições mais suaves 13 , 14 , por exemplo , metanol / carbonato de potássio (MeOH / K 2 CO 3 ) ou butilamina. Assim, é necessário um conjunto diferente de grupos de proteção sobre os fosforamidites correspondentes. Além disso, escolhemos a eletroforese como a alternativa preferida para purificar os oligómeros desprotegidos, dada a nossa experiência anterior com este método e a falta de outras instrumentações. No entanto, a HPLC pode alternativamente ser utilizada como um método eficaz 15 . A caracterização dos oligonucleótidos purificados foi realizada através de espectrometria de massa, dessorção / ionização de laser assistida por matriz – tempo de voo (MALDI-TOF), utilizando um procedimento relatado pelo nosso grupo 16 .
Caracterização estrutural e A estabilidade incorreta dos duplexs obtidos foi realizada via CD. Especificamente, utilizamos o CD para determinar as transições de desnaturação térmica de oligonucleótidos modificados e não modificados de RNA seguindo a diminuição da elipticidade da banda em aprox. 270 nm, bem como o desaparecimento da banda (com elipticidade negativa) com λ máx . A 210 nm. Uma comparação de espectros antes e após a hibridação é fornecida para ilustrar suas diferenças e fornecer a validação da metodologia empregada. O uso de CD é amplamente aceito na determinação de motivos estruturais em ácidos nucleicos e aminoácidos 17 e, portanto, pode ser empregado como uma ferramenta para determinar vários parâmetros estruturais e termodinâmicos 18 ; No entanto, não há muitos exemplos em que a técnica é utilizada para avaliar as transições de desnaturação térmica. Alguns casos incluem a determinação de estabilidades térmicas em ADN contendo quadruplexos GAss = "xref"> 19 , 20 ou em duplex e grampos de RNA 21 .
Este relatório pretende fornecer ao leitor ou espectador não especialista um conjunto de ferramentas que permitem um bom início desse tipo de pesquisa. Isso servirá para melhorar e comparar com metodologias e técnicas em outros laboratórios de pesquisa que estão envolvidos neste poderoso ramo da ciência. O conteúdo deste relatório adiciona aos protocolos existentes desta tecnologia de várias fontes, e enriquece e facilita a experiência com um auxílio visual para cada etapa.
Protocol
Representative Results
Discussion
A intenção deste manuscrito é servir como um guia para pesquisadores no campo, iniciante ou especialista, para alcançar com sucesso ou melhorar a síntese de oligonucleótidos de DNA ou RNA. A metodologia descrita enfoca o uso de síntese de fase sólida usando um sintetizador automatizado de DNA / RNA através de química padrão de fosforamidite. O relatório descreve uma descrição passo-a-passo da síntese, purificação e caracterização de dodecamers de RNA. Além disso, o uso de CD é utilizado para identif…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A preparação deste manuscrito foi apoiada por meio de fundos iniciais da Universidade de Colorado Denver (JMRE). A AF gostaria de reconhecer o apoio de um prêmio de Pesquisa e Atividades Criativas (RaCAS, CU Denver). Financiamento do Escritório de Serviços de Pesquisa, Universidade de Denver Colorado para cobrir os custos de publicação é reconhecido. Gostaríamos de agradecer aos membros do laboratório, Sra Cassandra Herbert e ao Sr. Yannick K. Dzowo, por suas contribuições na seção de vídeo.
Materials
| AbsolveTM | PerkinElmer | 6NE9711 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC Grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Acetonitrile 99.9%, anhydrous for DNA sequencing | Fisher BioReagents | 75-05-8 | |
| Acrylamide, 99+% | ACROS Organics | 164850025 | |
| Ammonium chloride 98+% | Alfa Aesar | 12125-02-9 | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Ammonium hydroxide 28-30% in water, ACS Plus | Fisher Chemical | 1336-21-6 | |
| Ammonium persulfate | ACROS Organics | 1444 | |
| Argon-ultra high purity | Airgas | 7440-37-1 | |
| Bis-acrylamide Ultra pure | VWR-Amresco | 172 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A73-1 | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Ethanol, anhydrous, histological grade | Fisher Chemical | 64-17-5 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dehydrate 100.2% | Fisher Chemical | 6381-92-6 | |
| Formamide | Thermo Scientific | 75-12-7 | |
| Hydrochloric acid, 36.5-38.0%, Certified ACS Plus | Fisher Chemical | 7647-01-0 | |
| Magnesium chloride hexahydrate, 99% | Fisher Scientific | 7786-30-3 | |
| Methanol, 99.9%, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Methylamine 40% in water | Sigma Aldrich | 74-89-5 | |
| 1-Methyl-2-pyrrolidinone, andhydrous, 99.5% | Aldrich | 872-50-4 | |
| Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm) | MDS SCIEX | 1020157 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| Sodium acetate, anhydrous 99.2%, Certified ACS | Fisher Chemical | 127-09-3 | |
| Sodium chloride, 100.5%, Certified ACS | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate 99.0% | Sigma | 13472-35-0 | |
| 2’,4’ Triethylamine, 99+% | Alfa Aesar | 121-44-8 | |
| TEMED | Amresco | 761 | |
| Triethylamine trihydrofluoride, 98% | Aldrich | 73602-61-6 | |
| Trifluoroacetic acid, 99% | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP154-3 | |
| Urea | Fisher Scientific | U15-3 | |
| Reagents for the RNA synthesis: | |||
| Deblocking mix, 3% trichloroacetic acid in dichloromethane | Glen Research | 40-4140-57 | |
| Cap Mix A, THF/Pyridine/Acetic anhydride | Glen Research | 40-4110-52 | |
| Cap Mix B, 10% 1-methylimidazole in THF | Glen Research | 40-4120-52 | |
| Activator, 0.25 M 5-ethylthio-1H-tetrazole in anhydrous acetonitrile | Glen Research | 30-3140-52 | |
| Oxidizing Solution, 0.02 M iodine in THF/Pyridine/Water | Glen Research | 40-4330-52 | |
| U-RNA-CPG | Glen Research | 20-3330-xx | |
| Ac-G-RNA-CPG | Glen Research | 20-3324-xx | |
| Ac-G-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3025-xx | |
| U-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3030-xx | |
| Ac-C-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3015-xx | |
| Bz-A-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3003-xx |
Referências
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