تشريح RPE-المشيمية والشبكية البشرية لتحليل البروتين
Summary
ويتألف من مناطق متميزة وظيفيا وجزيئيا، بما في ذلك منتظمة، والبقعة، والشبكية الطرفية شبكية العين البشرية. هنا، يمكننا وصف أسلوب استخدام الخزعات لكمه والإزالة اليدوية لطبقات الأنسجة من عين بشرية لتشريح وجمع هذه المناطق الشبكية متميزة لتحليل البروتين المتلقين للمعلومات.
Abstract
شبكية العين البشرية تتألف من نيوروريتينا الحسية والكامنة وراء ظهارة المصطبغة الشبكية (RPE)، الذي الرصاصية بشدة على الطبقة تشورويد الأوعية الدموية. مناطق مختلفة من الشبكية تختلف تشريحيا وجزيئيا، تسهيل مهام فريدة من نوعها، ومما يدل على وضعية للمرض. تحليل البروتين لكل من هذه المناطق والطبقات يمكن أن توفر أفكاراً حيوية في العملية الجزيئية للعديد من الأمراض، بما في ذلك ضمور بقعي أجيريلاتيد (AMD) ومرض البول السكري والزرق. ومع ذلك، فصل مناطق الشبكية وطبقات ضروري قبل أن يمكن إنجاز تحليل كمية البروتين. هنا، نحن تصف طريقة للتشريح وجمع المناطق الشبكية نقري والقرنية، والأجهزة الطرفية والكامنة وراء مجمع RPE-المشيمية، والتي تنطوي على خزعات لكمه الإقليمية والإزالة اليدوية لطبقات الأنسجة من عين بشرية. يمكن استخدام صفحة الحزب الديمقراطي الصربي أحادي الأبعاد، فضلا عن تحليل البروتين المتلقين للمعلومات، مثل السائل اللوني-جنبا إلى جنب الكتلي (LC-MS/MS)، لتحديد البروتينات في كل طبقة الشبكية تشريح، الكشف عن المؤشرات الحيوية الجزيئية لأمراض الشبكية.
Introduction
الشبكية و RPE المشيمية هي الأنسجة المعقدة التي توضح الاختلافات الإقليمية الهامة في التعبير البروتين والوظيفة الفسيولوجية والمرضية مخطوطا1،2. على سبيل المثال، تظهر الأمراض مثل تنكس بقعي أجيريلاتيد (AMD)، والتهاب الشبكية الصباغي، واعتلال الشبكية المصلي وسط كل الترجمة مميزة داخل منتظمة أو البقعة الشبكية الطرفية1،3، 4،6. نقدم هنا، طريقة تثبت الشبكية متميزة كيف يمكن تذوق المناطق بشكل مستقل. والهدف العام لهذا الأسلوب تقديم دليل موثوق به لجمع عينات الأنسجة من المناطق نقري والقرنية والطرفية RPE-المشيمية والشبكية البشرية لتحليل البروتين. الأساس المنطقي لتطوير واستخدام هذا الأسلوب أنه من خلال تحليل البروتين هذه المناطق الشبكية محددة، قد اكتسبت رؤى الجزيئية في الوظائف الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية لهذه المناطق الهامة.
وعود هذا النهج الكشف عن أساس البروتين مخطوطا المرض الإقليمي النسبي، وتيسيرا لتحديد أهداف علاجية محددة جديدة. وفي الواقع، وفرت التحقيقات البروتين الجسم الزجاجي وتفاعلاته مع الشبكية أفكاراً رئيسية في التركيب الجزيئي ووظيفة الأنسجة السليمة والمريضة5،،من78 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13-ومع ذلك، تفتقر إلى تحليل البروتين مقارنة واضحة لمناطق الشبكية متميزة. التقنية سوف تساعد على دعم هذه الدراسات اللازم، وتوفير مزايا أكثر من غيرها من الأساليب بإظهار نهج جمع أنسجة يمكن الاعتماد عليها واستنساخه. أكثر من ذلك، النهج الوصول للغاية، مع الاستفادة من الحجم العادي ومتاحة بسهولة الأنسجة لكمه أدوات خزعة. ويؤكد لدينا تقنية مناسبة جمع وتخزين الأنسجة للبروتين التجهيز، مما يجعل من الاعتبارات الهامة للبروتين الاستقرار وتدهور. وهكذا، هذا الأسلوب الأنسب للمحققين النظر في المصب التحليل الجزيئي لعوامل البروتين.
Protocol
Representative Results
Discussion
بعد الأنسجة يتم جمع ومعالجة عينة ومعالجة الاعتبارات الحاسمة14. يفضل حفظها في النتروجين السائل على التثبيت الكيميائي، كما هذا الأخير قد ينتج عنه تلف لهيكل البروتين، التي يمكن أن تحرف تحليل المتلقين للمعلومات. بالإضافة إلى ذلك، يفضل الحفاظ على النتروجين السائل للأساليب التي ل?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
VBM تدعمها المنح المعاهد الوطنية للصحة [K08EY020530، R01EY024665، R01EY025225، R01EY024698، و R21AG050437], “دوريس ديوك الخيرية منحة من مؤسسة” #: 2013103، وإجراء البحوث لمنع العمى (تجمع الشعب البوروندي)، نيويورك، نيويورك. طن متري وغف معتمدة من قبل المعهد الوطني للصحة منح T32GM007337.
Materials
| 4-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-34 | |
| 8-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-37 | |
| 0.12 Colibri Forceps | Stephens Instruments | S5-1145 | |
| Wescott Scissors | Sklar Surgical Instruments | 64-3146 | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | #022364111 | 1.5 mL |
| Liquid Nitrogen | Praxair, Inc. | 7727-37-9 [R] |
Referências
- Chirco, K. R., Sohn, E. H., Stone, E. M., Tucker, B. A., Mullins, R. F. Structural and molecular changes in the aging choroid: implications for age-related macular degeneration. Eye (Lond). , (2016).
- Zhang, P., et al. Defining the proteome of human iris, ciliary body, retinal pigment epithelium, and choroid. Proteomics. 16 (7), 1146-1153 (2016).
- Funke, S., et al. Glaucoma related Proteomic Alterations in Human Retina Samples. Sci Rep. 6, 29759 (2016).
- Decanini, A., et al. Human retinal pigment epithelium proteome changes in early diabetes. Diabetologia. 51 (6), 1051-1061 (2008).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Dissection of human vitreous body elements for proteomic analysis. J Vis Exp. (47), (2011).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Proteomic landscape of the human choroid-retinal pigment epithelial complex. JAMA Ophthalmol. 132 (11), 1271-1281 (2014).
- Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. J Vis Exp. (50), (2011).
- Skeie, J. M., et al. Proteomic analysis of vitreous biopsy techniques. Retina. 32 (10), 2141-2149 (2012).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Proteomic interactions in the mouse vitreous-retina complex. PLoS One. 8 (11), e82140 (2013).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M. Translational vitreous proteomics. Proteomics Clin Appl. 8 (3-4), 204-208 (2014).
- Skeie, J. M., Roybal, C. N., Mahajan, V. B. Proteomic insight into the molecular function of the vitreous. PLoS One. 10 (5), e0127567 (2015).
- Velez, G., et al. Precision Medicine: Personalized Proteomics for the Diagnosis and Treatment of Idiopathic Inflammatory Disease. JAMA Ophthalmol. 134 (4), 444-448 (2016).
- Velez, G., et al. Proteomic analysis of elevated intraocular pressure with retinal detachment. Am J Ophthalmol Case Rep. 5, 107-110 (2017).
- Skeie, J. M., et al. A biorepository for ophthalmic surgical specimens. Proteomics Clin Appl. 8 (3-4), 209-217 (2014).
- Ferrer, I., et al. Brain protein preservation largely depends on the postmortem storage temperature: implications for study of proteins in human neurologic diseases and management of brain banks: a BrainNet Europe Study. J Neuropathol Exp Neurol. 66 (1), 35-46 (2007).
- Ahmed, M. M., Gardiner, K. J. Preserving protein profiles in tissue samples: differing outcomes with and without heat stabilization. J Neurosci Methods. 196 (1), 99-106 (2011).
- Kanshin, E., Tyers, M., Thibault, P. Sample Collection Method Bias Effects in Quantitative Phosphoproteomics. J Proteome Res. 14 (7), 2998-3004 (2015).
- Crecelius, A., et al. Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE. Proteomics. 8 (6), 1276-1291 (2008).
- Oka, T., Tagawa, K., Ito, H., Okazawa, H. Dynamic changes of the phosphoproteome in postmortem mouse brains. PLoS One. 6 (6), e21405 (2011).
- Nagy, C., et al. Effects of postmortem interval on biomolecule integrity in the brain. J Neuropathol Exp Neurol. 74 (5), 459-469 (2015).
- Mukherjee, S., et al. Proteomic analysis of frozen tissue samples using laser capture microdissection. Methods Mol Biol. 1002, 71-83 (2013).
