Dissektion af menneskelige nethinde og RPE-choroidea proteom analyse

Summary

Den menneskelige nethinde består af funktionelt og molekylært forskellige regioner, herunder fovea, gule plet og perifere retina. Her, beskriver vi en metode ved hjælp af punch biopsier og manuel fjernelse af væv lag fra en menneskelige øje at dissekere og indsamle disse særskilte retinal regioner for downstream proteom analyse.

Abstract

Den menneskelige nethinde er sammensat af de sensoriske neuroretina og den underliggende retinal pigmenteret epitel (ÅV), som er fast kompleksbundet til vaskulær plexus lag. Forskellige områder af nethinden er anatomisk og molekylært adskilte, lette unikke funktioner og demonstrere differential modtagelighed for sygdom. Proteom-analyse af hver af disse regioner og lag kan give afgørende indsigt i de molekylære proces af mange sygdomme, herunder aldersbetingede Macula Degeneration (AMD), diabetes mellitus og grøn stær. Adskillelse af retinale regioner og lag er imidlertid afgørende, før kvantitative proteom analyse kan opnås. Her, beskriver vi en metode til dissektion og samling af foveal, makulært og perifere retinale regioner og underliggende ÅV-choroidea kompleks, der inddrager regionale punch biopsier og manuel fjernelse af væv lag fra en menneskelige øje. Endimensional SDS-PAGE samt downstream proteom analyse, såsom liquid chromatography-tandem massespektrometri (LC-MS/MS), kan bruges til at identificere proteiner i hvert dissekeret retinal lag, afslørende molekylære markører for retinal sygdom.

Introduction

Nethinden, ÅV og årehinden er komplekse væv, der viser vigtige regionale forskelle i protein udtryk, fysiologiske funktion og patologiske modtagelighed^1,2. For eksempel, vise sygdomme som aldersbetingede Macula Degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, og central serøs retinopati hver karakteristiske lokalisering i fovea, gule plet eller nethinden periferien^{1,3, 4,6}. Her præsenterer vi en metode viser, hvordan forskellige retinal regioner kan udtages uafhængigt. Det overordnede mål med denne metode er at give en pålidelig guide til samling af vævsprøver fra foveal, makulært og perifere regioner i den menneskelige nethinde og RPE-choroidea proteom analyse. Begrundelsen for udvikling og anvendelse af denne teknik er der gennem proteom analyse af disse specifikke retinal regioner, vigtige molekylære indsigt kan opnås i de fysiologiske og patofysiologiske funktioner i disse regioner.

Denne tilgang lover at afsløre proteom grundlaget for relative regionale sygdom modtagelighed, og til at lette identifikationen af nye specifikke terapeutiske mål. Faktisk, proteom undersøgelser af glaslegemet og dens samspil med nethinden har givet indsigt i de molekylære sammensætning og funktion af sund og syge væv^{5,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. imidlertid klart sammenlignende proteom analyser af forskellige retinal regioner mangler. Teknikken, der vil bidrage til at støtte disse meget nødvendige undersøgelser, giver fordele i forhold til andre metoder ved at demonstrere en pålidelig og reproducerbar væv samling tilgang. Mere så er tilgangen meget tilgængeligt, at drage fordel af standardstørrelse og let tilgængelige væv punch biopsi værktøjer. Vores teknik understreger passende indsamling og opbevaring af væv til proteom behandling, at gøre vigtige overvejelser for protein stabilitet og nedbrydning. Således, denne metode er mest hensigtsmæssige for efterforskerne overvejer downstream Molekylær analyse af proteom faktorer.

Protocol

denne undersøgelse blev godkendt ved University of Iowa ' s institutionelle Review Board og overholder de grundsætninger, der er anført i Helsinki-erklæringen. 1. Foveal og makulært biopsi Punch åben og butterfly menneskelige øje, således at det består af 4 separate sildelapper af væv, som beskrevet i en tidligere publikation. 5 begynder med en butterflied menneskelige øje anbringes i en petriskål, centrere en 4-mm punch biopsi vær…

Representative Results

Retinal og RPE-choroidea væv kan behandles på forskellige måder der passer til en individuel undersøgelse. Efter samling, vil forskeren besidder prøver af retinal og RPE-choroidea væv fra foveal region, ydre macula og perifere retina (figur 1). Specifikt, vil foveal region punchen omfatte fovea, parafovea og en lille mængde af de tilstødende perifovea. Den makulært punch omfatter resten af regionen perifoveal samt en lille mængde af de tilstødende …

Discussion

Efter væv er indsamling, prøve håndtering og behandling afgørende betragtninger¹⁴. Opbevaring i flydende nitrogen foretrækkes frem for kemiske fiksering, da sidstnævnte kan resultere i skader til protein struktur, som kunne vride downstream analyse. Derudover er flydende kvælstof bevarelse foretrækkes frem for metoder, som ikke indebærer indefrysning af prøver. Navnlig Ferrer et al. viste betydelige forskelle i protein niveauer mellem hjernen prøver bevaret på 4 ° C eller stu…

Materials

4-mm skin punch biopsy tool	Miltex	REF 33-34
8-mm skin punch biopsy tool	Miltex	REF 33-37
0.12 Colibri Forceps	Stephens Instruments	S5-1145
Wescott Scissors	Sklar Surgical Instruments	64-3146
Microfuge tubes	Eppendorf	#022364111	1.5 mL
Liquid Nitrogen	Praxair, Inc.	7727-37-9 [R]