Dissektion der menschlichen Netzhaut und RPE-Aderhaut für Proteomic Analysen

Summary

Die menschliche Netzhaut besteht aus funktional und molekular verschiedene Regionen, einschließlich der Fovea, der Makula und der peripheren Netzhaut. Hier beschreiben wir eine Methode mit Stanzbiopsien und manuelle Entfernung von Gewebeschichten von einem menschlichen Auge zu zerlegen und diese verschiedenen retinalen Regionen für nachgeschaltete Proteomic Analysen zu sammeln.

Abstract

Die menschliche Netzhaut besteht aus der sensorischen Neuroretina und die zugrunde liegenden Netzhaut pigmentierten Pigmentepithels (RPE), ist fest auf die vaskuläre choroid Schicht komplexiert. Verschiedene Regionen der Netzhaut unterscheiden sich anatomisch und molekular, einzigartige Funktionen zu erleichtern und zeigen unterschiedliche Anfälligkeit für Krankheiten. Proteomic Analysen der einzelnen Regionen und Schichten bieten wichtige Einblicke in den molekularen Prozess von vielen Krankheiten, einschließlich altersbedingter Makula-Degeneration (AMD), Diabetes Mellitus und Glaukom. Trennung von retinalen Regionen und Schichten ist jedoch unerlässlich, bevor quantitative Proteomik Analyse erreicht werden kann. Hier beschreiben wir eine Methode zur Präparation und Sammlung von der Fovea, Makula und peripheren Netzhaut Regionen und RPE-Aderhaut-Komplex zugrunde, an denen regionalen Stanzbiopsien und manuelle Entfernung von Gewebeschichten von einem menschlichen Auge. Eindimensionale SDS-PAGE als auch nachgelagerte Proteomic Analysen, wie z.B. flüssige Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS), lässt sich Proteine in jeder seziert retinalen Schicht zu identifizieren enthüllt molekularen Biomarker für Netzhauterkrankung.

Introduction

RPE, Netzhaut und Aderhaut sind komplexe Gewebe, die wichtige regionale Unterschiede in pathologischen Empfindlichkeiten^1,2Proteinexpression und physiologische Funktion zu demonstrieren. Beispielsweise zeigen Krankheiten wie altersbedingte Makula-Degeneration (AMD), Retinitis Pigmentosa und zentrale seröse Retinopathie charakteristische Lokalisation innerhalb der Fovea, der Makula oder der Netzhaut Peripherie^{1,3, 4,6}. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zeigen, wie unterschiedliche Retinal Regionen unabhängig verkostet werden können. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, einen zuverlässigen Kompass für die Sammlung von Gewebeproben aus der fovealen, Makula und peripheren Regionen der menschlichen Netzhaut und RPE-Aderhaut für Proteomic Analysen zur Verfügung zu stellen. Die Gründe für die Entwicklung und Nutzung dieser Technik ist, dass durch Proteomic Analysen dieser spezifischen retinalen Regionen wichtig, dass molekulare Erkenntnisse kann über die physiologische und pathophysiologischen Funktionen dieser Regionen.

Dieser Ansatz verspricht die Proteomik-Basis für relative regionale Krankheit Empfindlichkeiten zu offenbaren und die Identifizierung von neuen spezifischen therapeutischen Ziele zu erleichtern. In der Tat boten Proteomic Untersuchungen des Glaskörpers und seine Wechselwirkungen mit der Netzhaut wichtige Einblicke in die molekularen Zusammensetzung und Funktion von gesundem und krankem Gewebe^{5,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. klar vergleichende Proteomic Analysen aus verschiedenen retinalen Regionen fehlen jedoch. Die Technik hilft, um diese dringend notwendigen Studien, bietet Vorteile gegenüber anderen Methoden durch eine zuverlässige und reproduzierbare Gewebe Sammlung Ansatz zu unterstützen. Um so mehr, ist der Ansatz sehr gut erreichbar, unter Ausnutzung der Standardgröße und leicht verfügbare Gewebe Punch Biopsie Werkzeuge. Unsere Technik betont entsprechende Erhebung und Speicherung von Geweben für die Proteomik Verarbeitung, so dass wichtige Überlegungen für die Proteinstabilität und Abbau. Daher ist diese Methode am besten geeignet für Ermittler in Anbetracht nachgelagerten molekulare Analyse der Proteomik Faktoren.

Protocol

diese Studie wurde von der University of Iowa genehmigt ' s Institutional Review Board und hält sich an den Grundsätzen, die in der Deklaration von Helsinki festgelegten. 1. Foveal und Makula Biopsie-Punch öffnen und Schmetterling, das menschliche Auge, so dass es besteht aus 4 separaten Klappen des Gewebes, wie in einer früheren Publikation beschrieben. 5 beginnend mit butterflied menschlichen Auge in einer Petrischale gelegt, zentrieren S…

Representative Results

Retinal und RPE-Aderhaut Gewebe können auf verschiedene Weise eine individuelle Untersuchung entsprechend verarbeitet werden. Nach der Entnahme verfügen die Forscher Proben von Retinal und RPE-Aderhaut-Gewebe aus der fovealen Region, äußere Makula und peripheren Netzhaut (Abbildung 1). Insbesondere gehören die Fovea Region Punch der Fovea, der Parafovea und eine kleine Menge der angrenzenden Perifovea. Der Makula Stempel beinhaltet den Rest von der Perif…

Discussion

Nach Gewebe sind Sammlung, Probenbehandlung und Behandlung wichtige Überlegungen¹⁴. Konservierung in flüssigem Stickstoff wird über chemische Fixierung, bevorzugt, da Letzteres beschädigt, Protein-Struktur kann die nachgelagerte Analyse verzerren könnten. Darüber hinaus ist flüssiger Stickstoff Erhaltung bevorzugt, Methoden, die keine Einfrieren der Proben beinhalten. Vor allem, Ferrer Et Al. zeigten erhebliche Unterschiede im Proteingehalt zwischen Gehirn Proben bei 4 ° C oder Ra…

Materials

4-mm skin punch biopsy tool	Miltex	REF 33-34
8-mm skin punch biopsy tool	Miltex	REF 33-37
0.12 Colibri Forceps	Stephens Instruments	S5-1145
Wescott Scissors	Sklar Surgical Instruments	64-3146
Microfuge tubes	Eppendorf	#022364111	1.5 mL
Liquid Nitrogen	Praxair, Inc.	7727-37-9 [R]