Disseksjon av Human netthinnen og RPE-akkord for Proteomic analyse

Summary

Human netthinnen består av funksjonelt og molecularly atskilte områder, inkludert fovea, macula og eksterne netthinnen. Her beskriver vi en metode som bruker punch biopsier og manuell fjerning av vev lag fra en øyet å dissekere og samle disse forskjellige retinal regioner for nedstrøms proteomic analyse.

Abstract

Human netthinnen består av sensorisk neuroretina og underliggende retinal pigmentert epitel (RPE), som er fast kompleksbundet på vaskulær choroid laget. Ulike regioner av netthinnen er anatomisk og molecularly tydelig, tilrettelegge unike funksjoner og demonstrere differensial mottakelighet for sykdom. Proteomic analyse av hver av disse regionene og lag kan gi viktig innsikt i molekylær prosessen med mange sykdommer, inkludert Age-Related Macular degenerasjon (AMD), diabetes mellitus og glaukom. Separasjon av netthinnen regioner og lag er imidlertid avgjørende før kvantitative proteomic analyse kan oppnås. Her beskriver vi en metode for disseksjon og samling av foveal, flekker og eksterne retinal regioner og underliggende RPE-akkord kompleks, regionale punch biopsier og manuell fjerning av vev lag fra en øyet. Endimensjonal SDS-side i tillegg til nedstrøms proteomic analyse, som flytende kromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS), kan brukes til å identifisere proteiner i hvert dissekert retinal lag, avslører molekylær biomarkers for retinal sykdom.

Introduction

Netthinnen, RPE, og akkord er komplekse vev som viser viktige regionale forskjeller i protein uttrykk, fysiologisk funksjon og patologisk mottakelighet^1,2. For eksempel demonstrere sykdommer som Age-Related Macular degenerasjon (AMD), retinitis pigmentosa og sentrale serous retinopati hver karakteristiske lokalisering i den fovea, macula eller netthinnen periferi^{1,3, 4,6}. Her presenterer vi en metode demonstrere hvordan forskjellige retinal regioner kan prøves uavhengig. Det overordnede målet med denne metoden er å gi en samling av fra foveal, flekker og eksterne regioner av human netthinnen og RPE-akkord for proteomic analyse. Begrunnelsen for utvikling og bruk av denne teknikken er gjennom proteomic analyse av disse spesifikke netthinnen regioner, viktig molekylær innsikt kan oppnås i fysiologiske og patofysiologiske funksjonene i disse regionene.

Denne tilnærmingen lover å avsløre proteomic grunnlaget for relativ regionale sykdom mottakelighet, og å lette identifisering av nye konkrete terapeutiske mål. Faktisk har proteomic undersøkelser av linsen og dens interaksjon med netthinnen gitt innblikk i molekylær komposisjon og funksjon av friske og syke vev^{5,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. imidlertid klart komparative proteomic analyser av forskjellige retinal regioner mangler. Teknikken hjelper for å støtte disse sårt tiltrengte studier, gir fordeler over andre metoder ved å demonstrere en pålitelig og reproduserbar vev samling tilnærming. Mer så, tilnærmingen er lett tilgjengelig, utnytter standardstørrelse og lett tilgjengelig vev punch biopsi verktøy. Våre teknikk understreker riktig innsamling og lagring av vev for proteomic behandling, noe som gjør viktige hensyn for protein stabilitet og fornedrelse. Dermed er denne metoden best egnet for etterforskere vurderer nedstrøms molekylær analyse av proteomic faktorer.

Protocol

denne studien ble godkjent av University of Iowa ' s institusjonelle Review Board og følger prinsippene fastsatt i erklæringen i Helsinki. 1. Foveal og macula biopsi Punch åpne og butterfly menneskelige øyet, slik at det består av 4 separate flaps av vev, som beskrevet i en tidligere publikasjon. 5 fra og med en butterflied øyet i en Petriskål kan midtstille et 4 mm punch biopsi verktøy over fovea, trykk ned og rulle forsiktig til et sn…

Representative Results

Retinal og RPE-akkord vev kan behandles på ulike måter som passer personlige etterforskning. Etter samlingen, vil hun ha prøver av retinal og RPE-akkord vev fra foveal regionen, ytre macula og eksterne netthinnen (figur 1). Spesielt inkluderer foveal regionen punsj fovea, parafovea og en liten mengde av tilstøtende man. Macula punsj inkluderer resten av regionen perifoveal samt en liten mengde tilstøtende nær perifere regionen. Til slutt, perifere slag …

Discussion

Etter vev er samling, prøve-håndtering og behandling avgjørende hensyn¹⁴. Bevaring i flytende nitrogen er foretrukket over kjemiske fiksering, som sistnevnte kan resultere i skade for proteinstruktur, som kan vri nedstrøms. I tillegg er flytende nitrogen bevaring foretrukket å metoder som ikke involverer frysing av prøver. Spesielt Ferrer et al. viste betydelige forskjeller i protein nivå mellom hjernen prøvene bevart på 4 ° C eller romtemperatur, sammenlignet med de lagret 0 °…

Materials

4-mm skin punch biopsy tool	Miltex	REF 33-34
8-mm skin punch biopsy tool	Miltex	REF 33-37
0.12 Colibri Forceps	Stephens Instruments	S5-1145
Wescott Scissors	Sklar Surgical Instruments	64-3146
Microfuge tubes	Eppendorf	#022364111	1.5 mL
Liquid Nitrogen	Praxair, Inc.	7727-37-9 [R]