Dissecação da Retina humana e RPE coroide para análise proteômica
Summary
A retina humana é composta de regiões funcionalmente e molecularmente distintas, incluindo a fóvea, mácula e retina periférica. Aqui, descrevemos um método usando o soco de biópsias e remoção manual das camadas de tecido do olho humano para dissecar e coletar estas regiões distintas da retina para análise proteômica a jusante.
Abstract
A retina humana é composta da neuroretina sensorial e o epitélio pigmentado da retina subjacente (RPE), que é complexado com firmeza à camada vascular da coroide. Diferentes regiões da retina são anatomicamente e molecularmente distintas, facilitando as funções originais e demonstrando o diferencial susceptibilidade à doença. Análise proteômica de cada uma destas regiões e camadas pode fornecer insights vitais sobre o processo molecular de muitas doenças, incluindo Age-Related Degeneração Macular (AMD), diabetes mellitus e glaucoma. No entanto, separação de camadas e regiões da retina é essencial antes de análise proteômica quantitativa pode ser realizado. Aqui, descrevemos um método para dissecção e coleção de regiões da retina central, periféricas e maculares e subjacentes RPE coroide complexo, envolvendo regional soco biópsias e remoção manual das camadas de tecido do olho humano. Unidimensional de SDS-PAGE, bem como análise de proteomic a jusante, tais como líquida espectrometria de massa em tandem-cromatografia (LC-MS/MS), pode ser usado para identificar proteínas em cada camada da retina dissecada, revelando moleculares biomarcadores para doenças da retina.
Introduction
A retina, RPE e coroide são tecidos complexos que demonstram diferenças regionais importantes na expressão de proteínas, função fisiológica e patológica suscetibilidades1,2. Por exemplo, doenças como a Degeneração Macular Age-Related (AMD), retinite pigmentosa e retinopatia serosa central cada demonstram característica localização dentro da fóvea, mácula ou retina periferia1,3, 4,6. Aqui, apresentamos um método demonstrando como distinta da retina regiões podem ser degustadas de forma independente. O objetivo geral deste método é fornecer um guia confiável para coleta de amostras de tecido da região macular, Central e periférica da retina humana e RPE coroide para análise proteômica. A justificativa para o desenvolvimento e a utilização desta técnica é que através da análise de proteomic destas regiões específicas da retina, importante introspecções moleculares podem ser adquiridas para as funções fisiológicas e fisiopatológicas destas regiões.
Esta abordagem promete revelar a base de proteomic para suscetibilidades doença regional relativo e para facilitar a identificação de novos alvos terapêuticos específicos. Com efeito, proteomic investigações sobre o vítreo e suas interações com a retina forneceu insights-chave na composição molecular e função dos tecidos saudáveis e doentes5,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. no entanto, análises de proteomic nítida de distintas regiões da retina são escassos. A técnica vai ajudar a apoiar estes estudos muito necessária, proporcionando vantagens sobre outros métodos demonstrando uma abordagem de coleta de tecido confiável e reprodutível. Mais ainda, a abordagem é muito acessível, aproveitando-se do ponche de tecido tamanho padrão e prontamente disponíveis a ferramentas de biópsia. Nossa técnica enfatiza a recolha e armazenamento de tecidos para proteomic processamento, fazendo considerações importantes para a estabilidade da proteína e degradação. Assim, este método é mais adequado para os investigadores a jusante análise molecular de proteomic factores a considerar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Depois de tecido recolha, manipulação de amostra e tratamento são cruciais considerações14. Preservação em nitrogênio líquido é preferida por fixação química, como o último pode resultar em danos à estrutura da proteína, que pode distorcer a análise a jusante. Além disso, a preservação de nitrogênio líquido é preferencial para métodos que não envolvem o congelamento de amostras. Notavelmente, Ferrer et al mostraram diferenças significativas nos níveis de proteí…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
VBM é suportada por concessões de NIH [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698 e R21AG050437], Doris Duke Charitable Foundation Grant #: 2013103 e pesquisa para evitar cegueira (RPB), New York, NY. MT e GV são suportados pelo NIH conceder T32GM007337.
Materials
| 4-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-34 | |
| 8-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-37 | |
| 0.12 Colibri Forceps | Stephens Instruments | S5-1145 | |
| Wescott Scissors | Sklar Surgical Instruments | 64-3146 | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | #022364111 | 1.5 mL |
| Liquid Nitrogen | Praxair, Inc. | 7727-37-9 [R] |
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