Dissektion av mänskliga näthinnan och RPE-åderhinnan för proteomiska analys
Summary
Den mänskliga näthinnan består av funktionellt och molekylärt distinkta regioner, inklusive fovea, gula fläcken och perifera näthinnan. Här, beskriver vi en metod där punch biopsier och manuellt borttagande av vävnad lager från ett mänskligt öga att dissekera och samla dessa olika retinala regioner för nedströms proteomiska analys.
Abstract
Den mänskliga näthinnan består av den sensoriska neuroretina och underliggande retinal pigmenterade epitel (RPE), vilket är ordentligt komplex i vaskulär koroidea skiktet. Olika regioner i näthinnan är anatomiskt och molekylärt distinkta, underlätta unika funktioner och demonstrera differentiell känslighet för sjukdom. Proteomiska analys av var och en av dessa regioner och lager kan ge viktiga insikter i den molekylära processen många sjukdomar, inklusive åldersrelaterad makula Degeneration (AMD), diabetes mellitus och glaukom. Separation av retinal regioner och lager är dock viktigt innan kvantitativa proteomiska analys kan åstadkommas. Här, beskriver vi en metod för dissektion och samling av foveal, makulaödem och perifera retinal regioner och underliggande RPE-åderhinnan complex, som omfattar regionala punch biopsier och manuellt borttagande av vävnad lager från ett mänskligt öga. Endimensionella SDS-PAGE samt nedströms proteomiska analys, till exempel liquid chromatography-tandem masspektrometri (LC-MS/MS), kan användas att identifiera proteiner i varje dissekerade näthinnans skikt, avslöjar molekylära markörer för retinal sjukdom.
Introduction
Näthinnan, RPE, och åderhinnan är komplexa vävnader som visar viktiga regionala skillnader i proteinuttryck, fysiologisk funktion och patologiska mottaglighet1,2. Till exempel påvisa sjukdomar såsom åldersrelaterad makula Degeneration (AMD), retinitis pigmentosa och central seröst retinopati varje karakteristiska lokalisering inom fovea, gula fläcken eller näthinnan periferin1,3, 4,6. Här presenterar vi en metod som visar hur distinkta retinal regioner kan avsmakas självständigt. Det övergripande målet med denna metod är att ge en pålitlig guide för samling av vävnadsprover från foveal, makulaödem och perifera regioner av mänskliga näthinnan och RPE-åderhinnan för proteomiska analys. Den logiska grunden för utveckling och användning av denna teknik är att genom proteomiska analys av dessa särskilda retinal regioner, viktiga molekylära insikter kan vinnas fysiologiska och patofysiologiska funktioner i dessa regioner.
Denna metod lovar att avslöja proteomiska grunden för relativa regionala sjukdom mottaglighet och för att underlätta identifiering av nya specifika terapeutiska mål. Faktiskt, proteomiska utredningar av glaskroppen och dess interaktioner med näthinnan har gett viktiga insikter i den molekylära sammansättning och funktion av frisk och sjuk vävnad5,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. dock tydlig jämförande proteomiska analyser av olika retinala regioner saknas. Tekniken hjälper till att stödja dessa välbehövliga studier, som ger fördelar jämfört med andra metoder genom att visa en tillförlitliga och reproducerbara vävnad samling strategi. Mer så, tillvägagångssättet är mycket lättillgängligt, dra nytta av standardstorlek och lättillgängliga vävnad punch biopsi verktyg. Vår teknik betonar lämplig insamling och lagring av vävnader för proteomiska bearbetning, att göra viktiga överväganden för protein stabilitet och nedbrytning. Således, denna metod är lämpligast för utredarna överväger nedströms molekylär analys av proteomiska faktorer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Efter vävnad är insamling, provhantering och behandling avgörande överväganden14. Bevarande i flytande kväve är att föredra framför kemiska fixering, som den senare kan resultera i skador på proteinstruktur, som kan förvränga nedströms analys. Dessutom, är flytande kväve bevarande rekommenderad till metoder som inte inbegriper frysning av prover. Särskilt, Ferrer et al. visade signifikanta skillnader i proteinnivåer mellan hjärnan prover bevaras vid 4 ° C eller rumstemp…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
VBM är stöds av NIH grants [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698 och R21AG050437], Doris Duke Charitable Foundation Grant nr: 2013103, och forskning att förhindra blindhet (RPB), New York, NY. MT och GV stöds av NIH bevilja T32GM007337.
Materials
| 4-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-34 | |
| 8-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-37 | |
| 0.12 Colibri Forceps | Stephens Instruments | S5-1145 | |
| Wescott Scissors | Sklar Surgical Instruments | 64-3146 | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | #022364111 | 1.5 mL |
| Liquid Nitrogen | Praxair, Inc. | 7727-37-9 [R] |
Referências
- Chirco, K. R., Sohn, E. H., Stone, E. M., Tucker, B. A., Mullins, R. F. Structural and molecular changes in the aging choroid: implications for age-related macular degeneration. Eye (Lond). , (2016).
- Zhang, P., et al. Defining the proteome of human iris, ciliary body, retinal pigment epithelium, and choroid. Proteomics. 16 (7), 1146-1153 (2016).
- Funke, S., et al. Glaucoma related Proteomic Alterations in Human Retina Samples. Sci Rep. 6, 29759 (2016).
- Decanini, A., et al. Human retinal pigment epithelium proteome changes in early diabetes. Diabetologia. 51 (6), 1051-1061 (2008).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Dissection of human vitreous body elements for proteomic analysis. J Vis Exp. (47), (2011).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Proteomic landscape of the human choroid-retinal pigment epithelial complex. JAMA Ophthalmol. 132 (11), 1271-1281 (2014).
- Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. J Vis Exp. (50), (2011).
- Skeie, J. M., et al. Proteomic analysis of vitreous biopsy techniques. Retina. 32 (10), 2141-2149 (2012).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Proteomic interactions in the mouse vitreous-retina complex. PLoS One. 8 (11), e82140 (2013).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M. Translational vitreous proteomics. Proteomics Clin Appl. 8 (3-4), 204-208 (2014).
- Skeie, J. M., Roybal, C. N., Mahajan, V. B. Proteomic insight into the molecular function of the vitreous. PLoS One. 10 (5), e0127567 (2015).
- Velez, G., et al. Precision Medicine: Personalized Proteomics for the Diagnosis and Treatment of Idiopathic Inflammatory Disease. JAMA Ophthalmol. 134 (4), 444-448 (2016).
- Velez, G., et al. Proteomic analysis of elevated intraocular pressure with retinal detachment. Am J Ophthalmol Case Rep. 5, 107-110 (2017).
- Skeie, J. M., et al. A biorepository for ophthalmic surgical specimens. Proteomics Clin Appl. 8 (3-4), 209-217 (2014).
- Ferrer, I., et al. Brain protein preservation largely depends on the postmortem storage temperature: implications for study of proteins in human neurologic diseases and management of brain banks: a BrainNet Europe Study. J Neuropathol Exp Neurol. 66 (1), 35-46 (2007).
- Ahmed, M. M., Gardiner, K. J. Preserving protein profiles in tissue samples: differing outcomes with and without heat stabilization. J Neurosci Methods. 196 (1), 99-106 (2011).
- Kanshin, E., Tyers, M., Thibault, P. Sample Collection Method Bias Effects in Quantitative Phosphoproteomics. J Proteome Res. 14 (7), 2998-3004 (2015).
- Crecelius, A., et al. Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE. Proteomics. 8 (6), 1276-1291 (2008).
- Oka, T., Tagawa, K., Ito, H., Okazawa, H. Dynamic changes of the phosphoproteome in postmortem mouse brains. PLoS One. 6 (6), e21405 (2011).
- Nagy, C., et al. Effects of postmortem interval on biomolecule integrity in the brain. J Neuropathol Exp Neurol. 74 (5), 459-469 (2015).
- Mukherjee, S., et al. Proteomic analysis of frozen tissue samples using laser capture microdissection. Methods Mol Biol. 1002, 71-83 (2013).
