Præsenteres her er en simpel metode til at skabe en high-density transposon indsættelse bibliotek i Escherichia coli eller Shigella flexneri ved hjælp af bakteriel konjugering. Denne protokol tillader oprettelsen af en samling af hundredvis af tusindvis af unikke mutanter i bakterier ved den tilfældige genomisk indsættelse af en transposon.
Transposon mutagenese er en metode, der giver mulighed for gen forstyrrelser via tilfældig genomisk indsættelse af et stykke DNA kaldet en transposon. Protokollen nedenfor skitserer en metode for højeffektiv overførsel mellem bakteriestammer af et plasmid husly en transposon indeholdende en kanamycin modstand markør. Plasmid-bårne transposase er kodet af en variant tnp gen, der indsætter transposon i genomet af den modtagende stamme med meget lav pattedyrsceller bias. Denne metode tillader således oprettelsen af store mutant biblioteker hvor transposoner er blevet indsat i unikke genomisk positioner i en modtagende stamme af enten Escherichia coli eller Shigella flexneri bakterier. Ved hjælp af bakteriel konjugering, i modsætning til andre metoder såsom elektroporation eller kemisk omdannelse, kan store biblioteker med hundreder af tusinder af unikke kloner oprettes. Dette giver high-density indsættelse biblioteker, med indsætninger forekommer så ofte som hver 4-6 base par i ikke-væsentlige gener. Denne metode er overlegen i forhold til andre metoder, da det giver mulighed for en billig, nem at bruge og høj effektivitet metode til etablering af et tæt transposon indsættelse bibliotek. Transposon-bibliotek kan bruges i downstream applikationer såsom transposon sekventering (Tn-FF.), for at udlede genetiske interaktion netværk, eller mere simpelt i mutationsmønstre (frem genetiske) skærme.
Oprettelsen af transposon mutagenese biblioteker i bakterier er nyttige for en bred vifte af applikationer, lige fra opdagelser af virulens gener i bakterielle patogener1,2, at undersøgelser af væsentlige gener3, 4 , 5 , 6, identifikation af genetiske interaktion netværk7,8,9. Kritisk til disse undersøgelser er evnen til at skabe et stort bibliotek af mutanter. Brugen af transposoner (korte brudstykker af DNA, som indsætter tilfældigt i en genom) er et simpelt middel for at forstyrre genfunktion, da indsættelsen af en transposon inden for åben behandling ramme eller lovgivningsmæssige område af et gen vil ofte afbryde funktion eller udtryk af genet.
Skitseret her er en metode til oprettelse af en transposon bibliotek i enten E. coli eller S. flexneri ved bakteriel konjugering med plasmidet pJA110. Der er to vigtigste fordele ved at bruge denne plasmid. Den første fordel er at varianten af den Tn10 transposase udtryk fra pJA1 plasmid inducerbar og har lav indsættelse bias11,12, hvilket betyder at transposon tilfældigt vil integrere i genomet når Isopropyl Β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) er føjet til medierne. Transposon indeholder kanamycin modstand markør, giver mulighed for valg af mutanter med transposon skær i kromosom af de modtagende stamme. Den anden fordel ved pJA1 plasmid er, at det indeholder et R6K mutant oprindelsen af replikering. R6K mutant oprindelsen af replikering kræver lambda pir gen i rækkefølge for vedligeholdelse af plasmid13. Som plasmidet ikke kan replikere i pir – stammer, vil det være tabt i den modtagende stamme (figur 1). Dette sikrer, at Tn10 transposase er fjernet fra cellen og er ikke længere aktiv, reducere yderligere mutationer efter hændelsen oprindelige gennemførelse.
Brugen af bakteriel konjugation at flytte pJA1 plasmid fra stamme, de donor til den modtagende stamme er fordelagtige for flere grunde. Konjugering er enkel og billig at udføre og behøver ikke speciel udstyr såsom en electroporator. Desuden, den høje effektivitet af bakteriel konjugation giver mulighed for et meget stort bibliotek (> 2 x 105 unikke indrykninger) skal opnås med et par milliliter (mL) af overnight bakteriekulturen6. Processen tager omkring to timer af hands-on tid sammen med tid til udrugning og vækst af bakterier. Langridge et al. 14 rapporteret udfører 130 electroporations at skabe en transposon mutagenese bibliotek af en størrelse svarende til, der beskrives her8, som er opnået med en enkelt konjugering. Brugen af 130 electroporations kræver arbejdskraft intensiv og tidskrævende forberedelse af electrocompetent celler og brugen af mange dyre materialer (fx, elektroporation kuvetter), til en pris på mere end $1.000 USD i forbrugsvarer alene. Andre undersøgelser10 har brugt lignende metoder, men med forskellige bakteriestammer, og opnåede langt mindre bibliotek størrelser (5 x 104 koloni danner enheder) end rapporteret her.
Noter på donor stamme: donor stamme bruges her er E. coli -stamme BW2076715 indeholdende pJA1 transposon plasmid16. Stamme BW20767 kan konjugat til andre stammer, foretager overførslen af pJA1 plasmid højeffektive. Også, ikke mindst BW20767 er lambda pir +. Som tidligere nævnt er plasmidet pJA1 kun kunnet opretholdes i stammer, der indeholder lambda pir genet. Denne stamme er kanamycin og ampicillin resistente. PJA1 plasmid indeholder ampicillin modstand markør, og kanamycin modstand markør er indeholdt i transposon. Denne stamme er vokset med udvælgelse på plasmidet bruge ampicillin på 100 µg/mL. Det er også værd at bemærke, at andre stammer husly constitutively udtrykt transposase gener er kendt for at være ustabil, og mens transposase bruges her er inducerbar kontrol, er der stadig en lav risiko for Utætte udtryk. Derfor foreslås det at passagen af denne stamme bør minimeres og en frisk streak bør tages fra en frossen kultur for hver ny bibliotek forberedelse. Donor stamme bruges her er tilgængelig fra vores lab efter anmodning.
Noter på stammen, der modtager: den modtagende stamme kan være en stamme af valg, såsom K12-afledte lab stammer af E. coli eller stammer af S.flexneri (også, se diskussion). Den modtagende stamme skal have en ekstra antibiotikaresistens markør, der ikke er kanamycin modstand, så donor stamme kan vælges mod. For den modtagende stamme, er en E. coli MG1655 stamme brugt her en indført spontane nalidixic syre mutation. Den spontane nalidixic syre mutant blev valgt af plating ud 2 mL af overnight kultur i 200 µL delprøver på plader der indeholder nalidixic syre på 30 µg/mL. En enkelt klon af MG1655 blev valgt, var resistente over for nalidixic syre til at blive den modtagende stamme. Derudover skal den modtagende stamme være lambda pir negative, som beskrevet ovenfor.
Oversigt: Når bakteriel konjugation har fundet sted og pJA1 plasmid er flyttet fra stammen, donor til den modtagende stamme, tilsætning af IPTG til medierne vil fremkalde udtryk for tnp -gen, som er under kontrol af IPTG-inducerbar lacIq/Ptac promoter (figur 1). Tnp gen på pJA1 er en mutant transposase, som har en lavere frekvens for indsættelse på Hotte steder6,10,11. Ved addition og induktion med IPTG, er transposon aktiveret og tilfældigt indsat i genomet. Plasmidet kan ikke opretholdes i lambda pir-modtageren stamme og går tabt.
Protokollen beskrevet her giver mulighed for opførelse af en tætte indsættelse bibliotek. Denne metode giver mulighed for oprettelse af en transposon bibliotek med over 2 x 105 unikke transposon mutanter bruger under 5 mL af kultur bind6. Det er relativt let at udføre, bruger reagenser findes i mest grundlæggende Mikrobiologi labs, er skalerbar og kræver lidt i vejen for dyrt udstyr eller forbrugsmaterialer såsom elektroporation kuvetter.
En væsentlig fordel ved denne metode er, at i teorien, har brugeren vidt spillerum i valget af enterobacterial modtager stammer. Dette papir, såvel som andre11, bruge E. coli som en modtagende stamme, men pJA1 plasmid har været anvendt med succes med andre enterobacterial modtager arter som Shigella flexneri6 og Salmonella enterica serovar Typhimurium stamme SL134410. Teoretisk, γ oprindelsen af replikering (oriR6Kγ) i pJA1 tillader denne plasmid skal opretholdes i en bred host range19, tillade, at den modtagende stamme er pir +. For nylig, nye metoder er blevet beskrevet som giver mulighed for opførelse af den pir + i en række enterobacterial stammer20, hvilket giver ekstra fleksibilitet. Derudover tillader regionen300 basepar mob fra RP4 plasmid i pJA1 konjugering overførsel af denne plasmid til en bred vifte af gram negative bakteriestammer19. Simpelthen sætte, denne metode kan teoretisk bruges med en bred vifte af modtagerens stammer, så længe flere betingelser er opfyldt: stammen, der er pir+, og er mærket med en antibiotisk resistens end kanamycin og donor stamme.
Et kritisk trin i protokollen ligger i estimeringen af ordentlig antallet af celler til plade ud i trin 4.1. Hvis kolonier er fordelt for tæt, de konkurrerer om næringsstoffer på pladen og mindre fit mutanter er outcompeted. Dette kan føre til en reduktion i det samlede antal af mutanter. Alternativt, hvis kolonier er fordelt alt for langt fra hinanden, vil der være for få kolonier på pladen, og det samlede antal agar plader for at opnå et stort bibliotek bliver belastende. Derfor, at opnå den rette balance med hensyn til kolonien antallet pr. plade er vigtigt.
Det er vigtigt at udføre den kontrol, der er anført i protokollen til at sikre trinene arbejder som beskrevet. Især, når du bruger nalidixic syre som en Counter markering mod donor stamme, er det vigtigt at sikre negative donor kontrol plader er gratis af kolonier. Dette skyldes, at der kan være en lav sats (ca 1 x 10-10)21 af spontan modstand mod nalidixic syre, giver falske positiver. Typisk, er konjugering og gennemførelse af ca 2 x 10-4 19. Derfor, er konjugering og gennemførelse af flere størrelsesordener større end satsen for spontan modstand mod nalidixic syre. Derfor, antallet af falske positiver i forhold til sande gennemførelse begivenheder er meget lav og anses for ubetydelig, når protokollen er i orden. Men hvis satserne for konjugation eller gennemførelse er væsentligt reduceret, (fra lav parring effektivitet og/eller mangel på induktion af transposase-gen med IPTG) og protokollen er skaleret til at kompensere for dette, så antallet af falske positiver (kloner, har ikke transposon indsat) kan også øge.
Nogle ændringer kan foretages til inkubation times i trin 3.2 og 3.10. Trin 3,2 stater, der konjugation bør forekomme i 6 timer, men vores erfaring, denne gang trin kan være varieret (dvs.4-7 h) uden at ændre resultaterne betydeligt. Derudover i trin 3.10, kan varigheden af kolonierne inkuberes på agar plader også justeres. Dette kan varieres afhængigt af den gennemsnitlige fordobling tid eller vækst rate af den modtagende stamme. Derudover er vores erfaring givet 18 h en række koloni størrelser, der angiver et bibliotek af forskellige fitness. Dog kolonier med stærkt reducerede fitness kan tage længere tid at vokse og dermed muligvis ikke synlige efter 18 h. Hvis denne metode anvendes til at finde kloner af ekstremt nedsatte fitness, kan længere inkuberingstider og færre kolonier på pladen til at reducere trængslen (dvs., 48 h, 50-300 kolonier) anvendes.
Yderligere faldgruber ved denne metode omfatter at det ikke er muligt at bruge en modtagende stamme, der er allerede kanamycin resistente. Det kan være muligt at bytte ud kanamycin modstand markør i pJA1 plasmid for en alternativ valgbar markør, såsom chloramphenicol modstand til at overvinde denne forhindring. Det kan også være værd at bemærke, at i teorien, det er muligt at bruge en modtagende stamme, der er resistent over for ampicillin, som pJA1 plasmid som indeholder ampicillin modstand markør er tabt kort efter overtagelsen.
Oprettelsen af et tæt transposon bibliotek i den genetiske baggrund for valg er potentielt fordelagtig for mange downstream applikationer. For eksempel, kunne en tætte transposon bibliotek bruges til at identificere auxotrophic mutanter ved hjælp af replica plating22 eller at identificere mutanter, der er defekt i oprettelse af en infektion1,2. For nylig, da DNA-sekventering omkostninger er faldet og nye teknologier som næste generation sequencing er blevet hverdagskost, transposon biblioteker har været anvendt med dyb DNA-sekventering for at få indsigt i gen væsentlighed, genfunktion, og genetiske interaktioner. Nogle af disse metoder er gennemgået i 23 og omfatter metoder såsom transposon-instrueret indsættelsen site sekventering (TraDIS), transposon sekventering (Tn-FF.), høj overførselshastighed indsættelse sporing af dyb sekventering (HITS), og indsættelse sekventering ( INSeq). Alle disse downstream metoder stole på opførelsen af tætte transposon indsættelse biblioteker. Mens andre vektorer kan skal bruges til særlig downstream metoder, giver protokollen beskrevet her en oversigt over de vigtigste proceduremæssige punkter til følge.
The authors have nothing to disclose.
Tak George kirken Lab for den slags gave af pJA1 plasmid. Jeg takker Fabienne Hamburger og Alex Boehm fra Urs Jenal Lab på Biozentrum i Basel for at få hjælp med bakteriel konjugering og for at give BW20767 stammen. Jeg takker også Olin Silander for nyttige redigeringer. Finansieringen af denne forskning blev leveret af midler fra Massey University i New Zealand og den schweiziske initiativ i systembiologi (projekt “Slaget X” tildeles Dirk Bumann) på universitetet i Basel, Schweiz.
0.45 micron nitrocellulose filters (sterile) | Millipore | HAWP02500 | Alternatively blotting paper can be used (listed below) |
Blotting paper cut into ~ 1 inch circles, then autoclave/sterilized in foil. There is no difference in efficiency between the nitrocellulose filters or blotting paper | GE life Sciences: product Grade 3MM Chr Blotting Paper, sheet, 46 × 57 cm | 3030-917 | Alternatively nitrocellose filters can be used (listed above) |
Metal Forceps, sterile | VWR/Global Science New Zealand | MURRE009/01 | |
Petri dishes, sterile, 90 mm diameter, 68 mL volume, 12.5 mL working volume. | Interlab New Zealand | 2303-1090 | |
Sterile glass spreaders | VWR/Global Science New Zealand | NZNZSPREADER | Alternatively sterile glass beads can be used for spreading culture onto plates (listed below) |
Sterile glass beads | VWR/Global Science New Zealand | HERE1080603 | Alternatively a sterile glass spreader can be used for spreading culture onto plates (listed above) |
Nalidixic acid (optional) | GoldBio.com | N-015-250 | |
Ampicillin sodium salt BioChemica | VWR/Global Science New Zealand | APLIA0839.0025 | prepare according to manufacturer recommendation |
Kanamycin sulfate BioChemica | VWR/Global Science New Zealand | APLIA1493.0010 | |
IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) | Thermofisher New Zealand | FMTR0393 | |
Difco Agar granulated | Fort Richard Laboratries/Interlab New Zealand | 214530 | |
Luria Broth Base (Miller's LB Broth Base) | Thermofisher | 12795-084 | |
Glycerol bidistilled 99,5 % | VWR/Global Science New Zealand | VWRC24388.320 | |
15 ml polypropelene sterile conical vials | VWR/Global Science New Zealand | CORN430791 | |
Microcentrifuge tubes, flat cap, 1.7ml, Ultra-clear PP, graduated, autoclavable and freezable | VWR/Global Science New Zealand | AXYGMCT-175-C | |
50ml Centrifuge tubes, Falcon, PP, conical, printed graduation, with flat screw caps, sterile | VWR/Global Science New Zealand | BDAA352070 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Incubator at 37C | |||
Autoclave for sterilizing media |