खमीर के दौरान समय के साथ mRNA स्तरों को मापने एस. cerevisiae Hypoxic प्रतिसाद
Summary
यहां, हम एक आरएनए-seq का उपयोग करते हुए समय के साथ mRNA स्तरों की निगरानी के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं जो S. cerevisiae कोशिकाओं की hypoxic प्रतिक्रिया के दौरान. इस विधि के लिए किसी भी सेलुलर प्रतिक्रिया के दौरान जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण अनुकूलित किया जा सकता है ।
Abstract
जीन अभिव्यक्ति में जटिल परिवर्तन आम तौर पर एक सेलुलर प्रतिक्रिया के एक बड़े हिस्से मध्यस्थता । प्रत्येक जीन अद्वितीय कैनेटीक्स के साथ अभिव्यक्ति बदल सकता है के रूप में जीन कई उत्तेजनाओं में से एक के विशेष समय से विनियमित है, रास्ते या माध्यमिक प्रभाव संकेतन । खमीर एस cerevisiaeमें हाइपोक्सिया के लिए पूरे जीन अभिव्यक्ति प्रतिक्रिया पर कब्जा करने के लिए, आरएनए-seq विश्लेषण हाइपोक्सिया करने के लिए जोखिम के बाद विशिष्ट समय में सभी जीनों के mRNA स्तरों पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया गया था । हाइपोक्सिया में बढ़ रही कोशिकाओं द्वारा स्थापित किया गया था ~ १००% N2 गैस । महत्वपूर्ण बात, अंय hypoxic अध्ययन के विपरीत, ergosterol और unसंतृप्त फैटी एसिड मीडिया के लिए नहीं जोड़ा गया है क्योंकि इन चयापचयों जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित । समय अंक हाइपोक्सिया के बाद 0-4 ज की सीमा में चुना गया क्योंकि उस अवधि जीन अभिव्यक्ति में बड़े बदलाव को दर्शाता है । हर समय बिंदु पर, मध्य लॉग hypoxic कोशिकाओं को जल्दी से फ़िल्टर और जमे हुए थे, के लिए जोखिम सीमित हे2 और जीन अभिव्यक्ति में सहवर्ती परिवर्तन । कुल आरएनए कोशिकाओं से निकाला गया था और mRNA, जो तब सीडीएनए में परिवर्तित किया गया था के लिए समृद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया । इस सीडीएनए से मल्टीप्लेक्स पुस्तकालयों को बनाया गया और एक अगली पीढ़ी के sequencer के एक लेन में आठ या अधिक नमूनों का अनुक्रम किया गया । एक के बाद अनुक्रमण पाइपलाइन का वर्णन किया है, जो गुणवत्ता के आधार trimming, पढ़ने के मानचित्रण और जीन प्रति पढ़ता की संख्या का निर्धारण भी शामिल है । आर सांख्यिकीय वातावरण के भीतर DESeq2 जीन है कि hypoxic समय अंक में से किसी एक में काफी परिवर्तन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । तीन जैविक प्रतिकृति के विश्लेषण से पता चला उच्च reproducibility, भिंन कैनेटीक्स के जीन और उंमीद की एक बड़ी संख्या हे2-विनियमित जीन । इन तरीकों का अध्ययन कैसे विभिंन जीवों की कोशिकाओं को समय पर हाइपोक्सिया जवाब और अंय सेलुलर प्रतिक्रियाओं के दौरान जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
Introduction
कई जीवों हाइपोक्सिया, या कम ओ2का जवाब, जीन अभिव्यक्ति 1,2,3बदलकर । इस प्रतिक्रिया में मदद करता है एक एरोबिक श्वसन के लिए महत्वपूर्ण सब्सट्रेट की कमी से निपटने के लिए और कई कृत्रिम प्रतिक्रियाओं के लिए, लेकिन यह भी एक बदलते redox राज्य के साथ 4। कई microarray अध्ययन एस cerevisiae में प्रदर्शन किया है कि जीन के सैकड़ों के mRNA स्तर हाइपोक्सिया के जवाब में बदलने के लिए 5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. हाल ही में, आरएनए-seq हाइपोक्सिया 13के दौरान समय के साथ जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया गया था । यहां प्रायोगिक विवरण प्रस्तुत किया और चर्चा की ।
हाइपोक्सिया विभिंन तरीकों से प्राप्त किया जा सकता है, प्रत्येक ओ2का एक अलग स्तर के उत्पादन । यहां, हाइपोक्सिया लगातार प्रवाह अल्ट्रा उच्च शुद्धता2 कुप्पी में, जो कम करती है [हे2] प्रतिलिपि कैनेटीक्स 10के साथ तुरंत भंग द्वारा स्थापित किया गया था । यह संभव है कि वहां कुछ हे2 अणुओं वर्तमान कि चयापचय और जीन अभिव्यक्ति में योगदान कर रहे हैं, लेकिन इस वातावरण anaerobic के बहुत करीब माना जाता है । ओ2के अभाव में, खमीर कोशिकाओं षयवस्तु, ergosterol और unसंतृप्त फैटी एसिड 4,12,14के संश्लेषित नहीं कर सकते । इस प्रकार, पिछले अध्ययनों इन चयापचयों जब ऑक्सीजन 5,10,15के बिना खमीर बढ़ शामिल है । हालांकि, कई hypoxic प्रतिक्रियाओं इन चयापचयों की कमी से मध्यस्थता कर रहे हैं और इस तरह उन्हें भरपाई hypoxic जीन अभिव्यक्ति प्रतिक्रियाओं 12,16रिवर्स. प्राकृतिक हाइपोक्सिया की नकल करने के लिए इन चयापचयों को मीडिया से नहीं जोड़ा गया । कम समय में है कि कोशिकाओं को इन आवश्यक चयापचयों की उपस्थिति के बिना हाइपोक्सिया के संपर्क में थे, वहां सेल मौत में कोई उल्लेखनीय वृद्धि (नहीं दिखाया गया डेटा) और न ही एक लंबे समय तक तनाव की प्रतिक्रिया 13।
प्रतिक्रिया भी तनाव और उसके जीनोटाइप पर निर्भर है । विशेष रूप से महत्वपूर्ण hypoxic प्रतिक्रियाएं 2के ज्ञात नियामकों के alleles हैं । S288C तनाव पृष्ठभूमि अत्यधिक वांछित है ताकि परिणाम अंय जीनोमिक इस तनाव के साथ प्रदर्शन के अध्ययन की तुलना में किया जा सकता है । हालांकि, S288C HAP1 जीन 17, hypoxic प्रतिक्रिया के लिए एक transcriptional नियामक महत्वपूर्ण की एक आंशिक नुकसान-समारोह एलील शामिल हैं । इस एलील की मरंमत S288C में Σ1278b तनाव पृष्ठभूमि 11से एक wildtype प्रतिलिपि का उपयोग कर रहा था ।
जीन अभिव्यक्ति सेलुलर पर्यावरण पर अत्यधिक निर्भर है । इस प्रकार, जब जीनोम चौड़ा mRNA विश्लेषण प्रदर्शन, यह एक निरंतर वातावरण बनाए रखने के समय, उत्तेजना, या जीनोटाइप जैसे एक और पैरामीटर बदलती महत्वपूर्ण है । अत्यधिक प्रतिलिपि परिणाम प्राप्त करने के लिए, अध्ययन के लिए इन तीन पद्धतियों पर विचार करें और उसके सभी जैविक या तकनीकी प्रतिकृति । सबसे पहले, एक ही प्रयोगकर्ता (ओं) को बाहर का अध्ययन करना चाहिए, क्योंकि तकनीकी प्रथाओं प्रयोगकर्ता भर में भिंन हो सकते हैं । दूसरा, सामग्री के एक ही बैच के विकास के मीडिया में इस्तेमाल किया जाना चाहिए के रूप में प्रत्येक बैच एक अलग संरचना है कि जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित कर सकते है । तीसरा, सेल चक्र प्रभाव को कम करने के लिए, प्रत्येक समय बिंदु विकास के मध्य लॉग चरण में अतुल्यकालिक कोशिकाओं से मिलकर होना चाहिए (1-2 x10 7 कोशिकाओं/एमएल) ।
जब निस्र्पक हाइपोक्सिया को जीन अभिव्यक्ति प्रतिक्रिया की तरह एक जटिल प्रतिक्रिया, एक समय पाठ्यक्रम विभिंन घटनाओं के कैनेटीक्स निर्धारित करने के लिए लाभप्रद है । विशिष्ट समय अंक चुना जाना चाहिए कि प्रतिक्रिया के प्रमुख परिवर्तन पर कब्जा होगा । इस अध्ययन में, 0 और 4 एच के बीच समय अंक मनाया गया, क्योंकि पिछले प्रयोगों से इस अवधि के दौरान जीन अभिव्यक्ति में व्यापक बदलाव का पता चला 13.
वैश्विक जीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए, आरएनए-seq 18,19इस्तेमाल किया गया था । इस विधि का उपयोग करता है अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रत्येक जीन की प्रतिलिपि के सापेक्ष बहुतायत निर्धारित करने के लिए । डीएनए microarray विश्लेषण की तुलना में, आरएनए-seq उच्च संवेदनशीलता दर्शाती है (कम प्रचुर मात्रा में टेप का पता लगाने के लिए), एक अधिक से अधिक गतिशील रेंज (अधिक गुना परिवर्तन को मापने के लिए) और बेहतर reproducibility (सही समय पर जीन अभिव्यक्ति का पालन करने के लिए). आम तौर पर, सबसे सेलुलर आरएनए राइबोसोमल आरएनए है तो कई तरीकों को विशिष्ट आरएनए प्रजातियों के लिए समृद्ध करने के लिए विकसित किया गया है 20. यहाँ पॉली-टी मोतियों को पाली-ए-युक्त mRNA टेप को शुद्ध किया जाता था, हालांकि विभिन्न व्यावसायिक रूप से उपलब्ध rRNA की कमी वाली किट भी mRNA संवर्धन में कारगर हो सकती थीं.
यहां, एस cerevisiae जीन अभिव्यक्ति प्रतिक्रिया हाइपोक्सिया के लिए विशेषता थी । कोशिकाओं को हाइपोक्सिया के संपर्क में थे और फिर आठ समय अंक (0, 5, 10, 30, ६०, १२०, १८० और २४० मिनट) पर नमूना । reproducibility पुष्टि करने के लिए और सांख्यिकीय परिवर्तित टेप की पहचान करने के लिए, तीन जैविक प्रतिकृति प्रदर्शन किया गया । आरएनए यांत्रिक व्यवधान और कॉलम शुद्धि द्वारा निकाला गया था, और फिर आरएनए-seq विश्लेषण के लिए कार्रवाई की । पोस्ट-sequencing पाइपलाइन वर्णन किया गया है और प्रोग्रामिंग स्क्रिप्ट प्रदान किए गए विश्लेषण की सटीक प्रतिकृति की अनुमति दें कि । विशेष रूप से, Trimmomatic 21, TopHat2 22, HTseq 23, आर सांख्यिकीय पर्यावरण 24, और DESeq2 पैकेज 25 आरएनए-seq डेटा की प्रक्रिया और ६०७ जीन है कि परिवर्तन के दौरान काफी बदलने की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया हाइपोक्सिया. प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) और प्रतिकृति की जीन अभिव्यक्ति तकनीक के reproducibility संकेत दिया । clustering और heatmaps व्यापक अभिव्यक्ति कैनेटीक्स से पता चला है, जबकि जीन आंटलजी (जाओ) विश्लेषण से पता चला कि कई सेलुलर प्रक्रियाओं, एरोबिक श्वसन की तरह, ऑक्सीजन विनियमित जीन के सेट में समृद्ध कर रहे हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन में हाइपोक्सिया के दौरान सभी जीनों के लिए mRNA स्तरों को खमीर के एस cerevisiaeमें मापा गया था । लक्ष्य को कैसे वैश्विक जीन अभिव्यक्ति एक नियंत्रित निकट anoxic वातावरण में वृद्धि के कारण परिवर्तन का विश…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम तकनीकी सलाह के लिए और आरएनए पुस्तकालय तैयारी और अनुक्रमण के लिए प्रिंसटन विश्वविद्यालय में एकीकृत जीनोमिक्स अनुक्रमण कोर सुविधा के लिए लुईस-Sigler संस्थान का धंयवाद । यह काम रोवन विश्वविद्यालय और NIH NIGMS R15GM113187 से M.J.H. को अनुदान द्वारा समर्थित था
Materials
| Enclosed dry incubator | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | Set at 30°C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures. |
| Micro-analysis Filter Holder | Millipore | XX1002530 | 25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125mL filtering flask |
| Strong vacuum | Edwards | E-LAB 2 | The “house” vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here. |
| 1000-mL flask | To act as vacuum trap. | ||
| ~2-foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in | Tygon | 38TT | Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system. |
| High-pressure N2 gas tank | 99.999% purity, >1000psi, with a regulator and gas flow controller | ||
| Autoclaved 500mL flask | Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain. | ||
| Autoclaved 250mL flasks | Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps. | ||
| Flask stoppers (size 6, two holes with 5mm diameter) | Sterilized with 70% ethanol. One for each flask. | ||
| Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm | Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes. | ||
| ~25-cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm | Tygon | E-3603 | One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol. |
| Sterile filter discs | Millipore | HAWP02500 | 25mm diameter, 0.45 µm pore size, one for each time point |
| Sterile dH2O (~100mL) | |||
| 1-mL cuvettes | For measuring OD600 (i.e., cell concentration) | ||
| 50-mL sterile centrifuge tubes | One for each time point | ||
| Clean and sterile tweezers | |||
| liquid nitrogen | For freezing cells | ||
| acid-washed beads | Sigma | G8772 | Keep at 4°C for lysing cells |
| Qiagen RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For RNA column purification |
| Qiagen RLT buffer | Prepare by adding 10µL of β-Mercaptoethanol per 1mL of RLT buffer, keep at 4C. | ||
| 2-mL collection tubes | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RPE | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RW1 | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| DNase I stock and working solutions | Qiagen | 79254 | The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550µL of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20°C) in single-use aliquots (80µL each). The stock solution should not be thawed and refrozen. |
| Buffer RDD | Qiagen | included in the Qiagen DNase Kit | |
| Ice cold 2-mL screw-cap tubes | For lysing cells during RNA extraction | ||
| bead mill homogenizer | Biospec Mini-Beadbeater-24 | 112011 | Keep in cold room |
| Bacto Peptone | BD | DF0118 | for liquid YPD media |
| Bacto Yeast Extract | BD | DF0886 | for liquid YPD media |
| glucose | Fisher | D16 | for liquid YPD media |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher | Q32856 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fisher | Q32853 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM RNA Assay Kit | Thermo Fisher | Q32855 | for measuring nucleic acid concentration |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | for measuring nucleic acid concentration |
| Commercial electrophoresis system | Agilent | Bioanalyzer 2100 | for measuring nucleic acid quality |
| Next-generation sequencer | Illumina | HiSeq 2500 | for sequencing libraries |
| automated liquid handling system | Wafergen | Apollo 324 | for creating sequencing libraries |
| PrepX PolyA mRNA Isolation Kit | Wafergen | 400047 | for isolating mRNA from total RNA |
| PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit | Wafergen | 400039 | for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA |
| Barcode Splitter | https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d | ||
| Samtools, which includes the gzip command | http://www.htslib.org/download/ | ||
| Trimmomatic | http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | ||
| Bowtie2 (installed before TopHat) | http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | ||
| TopHat | https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml | ||
| HTSeq | http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html | ||
| R (installed before R Studio) | https://cran.rstudio.com | ||
| R Studio (free version) | https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
Referências
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