Måling af mRNA niveauer Over tid under gær S. cerevisiae hypoksiske svar
Summary
Vi præsenterer her, en protokol, ved hjælp af RNA-seq for at overvåge mRNA niveauer over tid under det hypoksiske svar af S. cerevisiae celler. Denne metode kan tilpasses til at analysere genekspression under nogen cellulære reaktion.
Abstract
Komplekse ændringer i genekspression mægle typisk en stor del af en cellulær svar. Hvert gen kan ændre udtryk med unik kinetik, som genet er reguleret af de særlige timing af en af mange stimuli, signalering veje eller sekundære virkninger. For at fange hele genet blev udtryk svar på iltsvind i gær S. cerevisiae, RNA-seq analyse brugt til at overvåge mRNA niveauer af alle gener på bestemte tidspunkter efter udsættelse for hypoxi. Hypoxi blev etableret af voksende celler i ~ 100% N2 gas. Vigtigere, i modsætning til andre hypoksiske undersøgelser, blev ergosterol og umættede fedtsyrer ikke føjet til medierne fordi disse metabolitter påvirker genekspression. Tid point blev valgt i intervallet fra 0 – 4 h efter hypoxi fordi denne periode indfanger de store ændringer i genekspression. På hvert tidspunkt, medio log hypoksiske celler blev hurtigt filtreret og frosset, begrænsning af eksponering til O2 og samtidige ændringer i genekspression. Total RNA blev udvundet af celler og bruges til at berige for mRNA, som blev derefter omdannet til cDNA. Fra denne cDNA, multiplex biblioteker var lavet og otte eller flere prøver blev sekventeret i én vognbane af en næste-generations sequencer. Efter sekvensering rørledning er beskrevet, som omfatter kvalitet base trimning, læse kortlægning og fastsættelsen af antallet af læser per genet. DESeq2 inden for R statistiske miljø blev brugt til at identificere gener, der ændrer væsentligt ved et af punkterne hypoksiske tid. Analyse af tre biologiske replikater viste høj reproducerbarhed, gener af forskellige kinetik og et stort antal forventede O2-reguleret gener. Disse metoder kan bruges til at undersøge, hvordan cellerne i forskellige organismer reagere på hypoxi med tiden og tilpasset til at studere genekspression under andre cellulære svar.
Introduction
Mange organismer reagere på hypoxi, eller lav O2, ved at ændre gen expression 1,2,3. Dette svar hjælper celler klare med manglen på en kritisk for aerob respiration og flere biosyntetiske reaktioner substrat, men også med en skiftende redox stat 4. Flere microarray undersøgelser udført i S. cerevisiae vis at mRNA niveauer af hundredvis af gener ændre svar på hypoxi 5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. for nylig, RNA-seq blev brugt til at karakterisere gen expression ændringer over tid under hypoxi 13. Her, de eksperimentelle detaljer præsenteres og diskuteres.
Hypoxi kan opnås på forskellige måder, hver producerer et andet niveau af O2. Her, hypoxi blev etableret af konstant strømmende ultra høj renhed N2 i flasker, der sænker [O2] opløst straks med reproducerbare kinetik 10. Det er muligt, at der er nogle O2 molekyler findes der bidrager til metabolisme og gen udtryk men dette miljø betragtes meget tæt på anaerobe. I mangel af O2, kan gærceller ikke biosynthesize hæm, ergosterol og umættede fedtsyrer 4,12,14. Således, tidligere undersøgelser har medtaget disse metabolitter, når de vokser gær uden ilt 5,10,15. Men mange hypoksiske svar er medieret af nedbrydningen af disse metabolitter og dermed efterfyldning dem vender hypoksiske gen expression svar 12,16. For at efterligne naturlige hypoxi, blev disse metabolitter ikke føjet til medierne. I den korte tid at celler blev udsat for hypoxi uden tilstedeværelsen af disse væsentlige metabolitter, var der ingen mærkbar stigning i celledød (data ikke vist) eller en langvarig stress respons 13.
Svaret er også afhængig af stammen og dens genotype. Specielt vigtigt er alleler af de kendte regulatorer af hypoksiske svar 2. S288C stamme baggrund er meget eftertragtede, således at resultaterne kan sammenlignes med de andre genomiske undersøgelser udført med denne stamme. S288C indeholder imidlertid en delvis tab af funktion allel af HAP1 genet 17, en transcriptional regulator kritisk til det hypoksiske svar. Denne allel blev repareret i S288C ved hjælp af en vildtype kopi fra Σ1278b stamme baggrund 11.
Genekspression er meget afhængige af den cellulære miljø. Derfor, når du udfører genome-wide mRNA analyse, er det vigtigt at opretholde en konstant miljø samtidig med varierende en anden parameter som tid, stimulus eller genotype. For at opnå meget reproducerbare resultater, overveje disse tre fremgangsmåder for undersøgelsen og alle dens biologiske eller tekniske replikater. Først, den samme experimenter(s) skal foretage undersøgelsen, da tekniske fremgangsmåder kan variere på tværs af eksperimentatorer. Andet, det samme parti af ingredienser skal bruges i vækst medier, som hvert parti har en lidt anderledes sammensætning, der kan påvirke genekspression. For det tredje for at minimere cellecyklus effekter, bør hvert tidspunkt bestå af asynkrone celler i midten log fase af vækst (1-2 x 107 celler/mL).
Når kendetegner en kompleks reaktion som gen expression svar på hypoxi, er et tidsforløb fordelagtige for bestemmelse af kinetik af forskellige arrangementer. Bestemt tidspunkt punkter bør vælges der vil fange de store forandringer af respons. I denne undersøgelse, blev tidspunkter mellem 0 og 4 h observeret, fordi tidligere eksperimenter revealed omfattende ændringer i genekspression under denne periode 13.
For at måle globale genekspression var RNA-seq brugt 18,19. Denne metode bruger next generation sequencing til at bestemme den relative forekomst af hvert gen udskrift. I forhold til DNA microarray analyse, udstiller RNA-seq højere følsomhed (at opdage mindre rigelige afskrifter), et større dynamikområde (til at måle større fold ændringer) og overlegen reproducerbarhed (til præcist følger genekspression over tid). Mest cellulære RNA er typisk ribosomale RNA så mange metoder er blevet udviklet for at berige for specifikke RNA arter 20. Her, poly-T perler blev brugt til at rense poly-A-holdige mRNA udskrifter, selv om de forskellige kommercielt – tilgængelige rRNA udtynding kits kunne også være effektiv i mRNA berigelse.
Her, var S. cerevisiae gen expression svar på hypoxi karakteriseret. Celler blev udsat for iltsvind og derefter stikprøven på otte tiden point (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180 og 240 min). At bekræfte reproducerbarhed og identificere statistisk ændrede udskrifter blev tre biologiske replikater udført. RNA blev udvundet ved mekaniske forstyrrelser og kolonne rensning, og derefter behandlet for RNA-seq analyse. Efter sekvensering rørledningen er beskrevet og programmering scripts er forudsat at give nøjagtige replikering af analyserne udføres. Specifikt, blev Trimmomatic 21, TopHat2 22, HTseq 23, R statistiske miljø 24og DESeq2 pakke 25 brugt til at behandle RNA-seq data og identificere 607 gener, der ændrer sig væsentligt i løbet hypoxi. Principal komponent analyse (PCA) og genekspression af replikater angivet reproducerbarhed af teknikken. Clustering og heatmaps afsløret vidtrækkende udtryk kinetik, mens gen ontologi (GO) Analysen viste, at mange cellulære processer, som aerob respiration, er beriget med ilt-regulerede gener sæt.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne undersøgelse, mRNA niveau for alle gener blev målt under hypoxi i gær S. cerevisiae. Målet var at analysere hvordan global gen expression ændringer som følge af vækst i en kontrolleret nær iltfrit miljø. Blev taget flere skridt til at sikre, at metoden beskrevet her var omhyggeligt kontrolleret og reproducerbar. Første celler blev udsat for et præcist definerede hypoksiske miljø: 99,999% N2 i rig medier (YPD). Andre undersøgelser af hypoxi har lukket kolbe eller rør til luft <sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Lewis-Sigler Institute for Integrativ genomforskning sekventering Core facilitet på Princeton University for teknisk rådgivning og RNA bibliotek forberedelse og sekventering. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Rowan Universitet og NIH NIGMS R15GM113187 til M.J.H.
Materials
| Enclosed dry incubator | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | Set at 30°C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures. |
| Micro-analysis Filter Holder | Millipore | XX1002530 | 25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125mL filtering flask |
| Strong vacuum | Edwards | E-LAB 2 | The “house” vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here. |
| 1000-mL flask | To act as vacuum trap. | ||
| ~2-foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in | Tygon | 38TT | Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system. |
| High-pressure N2 gas tank | 99.999% purity, >1000psi, with a regulator and gas flow controller | ||
| Autoclaved 500mL flask | Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain. | ||
| Autoclaved 250mL flasks | Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps. | ||
| Flask stoppers (size 6, two holes with 5mm diameter) | Sterilized with 70% ethanol. One for each flask. | ||
| Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm | Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes. | ||
| ~25-cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm | Tygon | E-3603 | One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol. |
| Sterile filter discs | Millipore | HAWP02500 | 25mm diameter, 0.45 µm pore size, one for each time point |
| Sterile dH2O (~100mL) | |||
| 1-mL cuvettes | For measuring OD600 (i.e., cell concentration) | ||
| 50-mL sterile centrifuge tubes | One for each time point | ||
| Clean and sterile tweezers | |||
| liquid nitrogen | For freezing cells | ||
| acid-washed beads | Sigma | G8772 | Keep at 4°C for lysing cells |
| Qiagen RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For RNA column purification |
| Qiagen RLT buffer | Prepare by adding 10µL of β-Mercaptoethanol per 1mL of RLT buffer, keep at 4C. | ||
| 2-mL collection tubes | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RPE | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RW1 | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| DNase I stock and working solutions | Qiagen | 79254 | The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550µL of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20°C) in single-use aliquots (80µL each). The stock solution should not be thawed and refrozen. |
| Buffer RDD | Qiagen | included in the Qiagen DNase Kit | |
| Ice cold 2-mL screw-cap tubes | For lysing cells during RNA extraction | ||
| bead mill homogenizer | Biospec Mini-Beadbeater-24 | 112011 | Keep in cold room |
| Bacto Peptone | BD | DF0118 | for liquid YPD media |
| Bacto Yeast Extract | BD | DF0886 | for liquid YPD media |
| glucose | Fisher | D16 | for liquid YPD media |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher | Q32856 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fisher | Q32853 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM RNA Assay Kit | Thermo Fisher | Q32855 | for measuring nucleic acid concentration |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | for measuring nucleic acid concentration |
| Commercial electrophoresis system | Agilent | Bioanalyzer 2100 | for measuring nucleic acid quality |
| Next-generation sequencer | Illumina | HiSeq 2500 | for sequencing libraries |
| automated liquid handling system | Wafergen | Apollo 324 | for creating sequencing libraries |
| PrepX PolyA mRNA Isolation Kit | Wafergen | 400047 | for isolating mRNA from total RNA |
| PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit | Wafergen | 400039 | for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA |
| Barcode Splitter | https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d | ||
| Samtools, which includes the gzip command | http://www.htslib.org/download/ | ||
| Trimmomatic | http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | ||
| Bowtie2 (installed before TopHat) | http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | ||
| TopHat | https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml | ||
| HTSeq | http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html | ||
| R (installed before R Studio) | https://cran.rstudio.com | ||
| R Studio (free version) | https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
Referências
- Semenza, G. L. Oxygen sensing, homeostasis, and disease. New Eng. J Med. 365 (6), 537-547 (2011).
- Butler, G. Hypoxia and gene expression in eukaryotic microbes. Annu. Rev. Micro. 67, 291-312 (2013).
- Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing and hypoxia signalling pathways in animals: the implications of physiology for cancer. J. Physiol. 591 (Pt 8), 2027-2042 (2013).
- Rosenfeld, E., Beauvoit, B. Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen bySaccharomyces cerevisiae. Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).
- Ter Linde, J. J., et al. Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 181 (24), 7409-7413 (1999).
- Ter Linde, J. J., Steensma, H. Y. A microarray-assisted screen for potential Hap1 and Rox1 target genes in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 19 (10), 825-840 (2002).
- Kwast, K. E., et al. Genomic analyses of anaerobically induced genes in Saccharomyces cerevisiae: functional roles of Rox1 and other factors in mediating the anoxic response. J. Bacteriol. 184 (1), 250-265 (2002).
- Becerra, M., et al. The yeast transcriptome in aerobic and hypoxic conditions: effects of hap1, rox1, rox3 and srb10 deletions. Mol. Microbiol. 43 (3), 545-555 (2002).
- Lai, L. -. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Dynamical remodeling of the transcriptome during short-term anaerobiosis in Saccharomyces cerevisiae: differential response and role of Msn2 and/or Msn4 and other factors in galactose and glucose media. Mol. Cell. Biol. 25 (10), 4075-4091 (2005).
- Lai, L. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Metabolic-State-Dependent Remodeling of the Transcriptome in Response to Anoxia and Subsequent Reoxygenation in Saccharomyces cerevisiae. Euk. Cell. 5 (9), 1468-1489 (2006).
- Hickman, M. J., Winston, F. Heme levels switch the function of Hap1 of Saccharomyces cerevisiae between transcriptional activator and transcriptional repressor. Mol. Cell. Biol. 27 (21), 7414-7424 (2007).
- Hickman, M. J., Spatt, D., Winston, F. The Hog1 mitogen-activated protein kinase mediates a hypoxic response in Saccharomyces cerevisiae. Genética. 188 (2), 325-338 (2011).
- Bendjilali, N., et al. Time-Course Analysis of Gene Expression During the Saccharomyces cerevisiae Hypoxic Response. G3. 7 (1), 221-231 (2017).
- Chellappa, R., et al. The membrane proteins, Spt23p and Mga2p, play distinct roles in the activation of Saccharomyces cerevisiae OLE1 gene expression. Fatty acid-mediated regulation of Mga2p activity is independent of its proteolytic processing into a soluble transcription activator. J. Biol. Chem. 276 (47), 43548-43556 (2001).
- Abramova, N. E., et al. Regulatory mechanisms controlling expression of the DAN/TIR mannoprotein genes during anaerobic remodeling of the cell wall in Saccharomyces cerevisiae. Genética. 157 (3), 1169-1177 (2001).
- Hughes, A. L., Todd, B. L., Espenshade, P. J. SREBP Pathway Responds to Sterols and Functions as an Oxygen Sensor in Fission Yeast. Cell. 120 (6), 831-842 (2005).
- Gaisne, M., Bécam, A. M., Verdière, J., Herbert, C. J. A "natural" mutation in Saccharomyces cerevisiae strains derived from S288c affects the complex regulatory gene HAP1 (CYP1). Curr. Gen. 36 (4), 195-200 (1999).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Gen. 10 (1), 57-63 (2009).
- Anders, S., Huber, W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol. 11 (10), R106 (2010).
- Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biol. 17 (1), 13 (2016).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq–A Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinf. 31 (2), 166-169 (2015).
- . R: A Language and Environment for Statistical Computing Available from: https://www.R-project.org (2015)
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- Brown, T., Mackey, K., Du, T. Analysis of RNA by Northern and Slot Blot Hybridization. Curr. Prot. Mol. Biol. 74, 4.9.1-4.9.19 (2004).
- Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nuc. Acids Res. 30 (1), 207-210 (2002).
- Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nuc. Acids Res. 40, D700-D705 (2012).
- Hothorn, T., Everitt, B. S. . A Handbook of Statistical Analyses using R. , (2014).
- Saldanha, A. J. Java Treeview–extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
- Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Nat. Acad. Sci. 95 (25), 14863-14868 (1998).
- Davies, B. S. J., Rine, J. A Role for Sterol Levels in Oxygen Sensing in Saccharomyces cerevisiae. Genética. 174 (1), 191-201 (2006).
- Meena, R. C., Kumar, N., Nath, S., Chakrabarti, A. Homologous Recombination is Activated at Early Time Points Following Exposure to Cobalt Chloride Induced Hypoxic Conditions in Saccharomyces cerevisiae. Ind. J. Microb. 52 (2), 209-214 (2012).
- Snoek, I. S. I., Tai, S. L., Pronk, J. T., Yde Steensma, H., Daran, J. -. M. Involvement of Snf7p and Rim101p in the transcriptional regulation of TIR1 and other anaerobically upregulated genes in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 10 (4), 367-384 (2010).
- Ellahi, A., Thurtle, D. M., Rine, J. The Chromatin and Transcriptional Landscape of Native Saccharomyces cerevisiae Telomeres and Subtelomeric Domains. Genética. 200 (2), 505-521 (2015).
- Collart, M. A., Oliviero, S., et al. Preparation of yeast RNA. Curr. Prot. Mol. Biol. , (2001).
- Blankenberg, D., et al. Manipulation of FASTQ data with Galaxy. Bioinf. 24 (14), 1783-1785 (2010).
- Martini, P., et al. timeClip: pathway analysis for time course data without replicates. BMC Bioinf. 15, (2014).
- Oh, S., Song, S., Grabowski, G., Zhao, H., Noonan, J. P. Time series expression analyses using RNA-seq: a statistical approach. BioMed Res. Int. 2013, 1-16 (2013).
