Mesurer les niveaux d’ARNm au fil du temps au cours de la levure s. cerevisiae réponse à l’hypoxie
Summary
Nous présentons ici un protocole utilisant RNA-seq pour surveiller les niveaux d’ARNm au fil du temps au cours de la réponse à l’hypoxie des cellules de S. cerevisiae . Cette méthode peut être adaptée pour analyser l’expression des gènes au cours de toute réaction cellulaire.
Abstract
Des changements complexes dans l’expression des gènes véhiculent généralement une grande partie d’une réponse cellulaire. Chaque gène peut changer l’expression avec une cinétique unique comme le gène est régulé par l’horloge particulière de l’un des nombreux stimuli, signalisation des voies ou des effets secondaires. Afin de capturer le gène tout réponse d’expression à l’hypoxie chez la levure S. cerevisiae, RNA-seq analyse a été utilisé pour surveiller les niveaux de mRNA des gènes à des moments précis après l’exposition à l’hypoxie. L’hypoxie a été créée par la croissance de cellules de ~ 100 % N2 gaz. Ce qui est important, contrairement aux autres études hypoxiques, ergostérol et acides gras insaturés ne s’ajoutèrent aux médias parce que ces métabolites affectent l’expression des gènes. Points dans le temps ont été choisis dans la gamme 0 – 4 heures après l’hypoxie, car cette période capte les changements majeurs dans l’expression des gènes. À chaque point dans le temps logarithmique cellules hypoxiques ont rapidement filtré et congelés, limiter l’exposition au O2 et concomitant des changements dans l’expression des gènes. L’ARN total a été extrait des cellules et utilisé pour l’enrichissement d’ARNm, qui était ensuite convertie en ADNc. De cet ADNc, multiplexes bibliothèques ont été créés et huit ou plusieurs échantillons ont été séquencés dans une seule voie d’un séquenceur de prochaine génération. Un pipeline après séquençage est décrite, qui comprend le découpage de base qualité, lire la cartographie et de déterminer le nombre de lectures par gène. DESeq2 dans l’environnement de statistique R servait à identifier les gènes qui changent de façon significative à n’importe lequel des points temps hypoxique. Analyse de trois réplicats biologiques a révélé une reproductibilité élevée, gènes des cinétiques différentes et un grand nombre d’attendre O2-gènes régulés. Ces méthodes peuvent être utilisées pour étudier comment les cellules des divers organismes répondent à une hypoxie au fil du temps et adaptés pour étudier l’expression des gènes au cours d’autres réponses cellulaires.
Introduction
Nombreux organismes réagissent à l’hypoxie ou faible O2, en modifiant l’expression de gène 1,2,3. Cette réponse aide les cellules à composer avec l’absence d’un substrat essentiel pour la respiration aérobie et plusieurs réactions de biosynthèse, mais aussi avec un changement redox état 4. Plusieurs études de microarray réalisées chez S. cerevisiae montrent que les taux d’ARNm de centaines de gènes changent en réponse à l’hypoxie 5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. récemment, RNA-seq a été utilisée pour caractériser les modifications de l’expression génique au fil du temps au cours de l’hypoxie 13. Ici, les détails expérimentaux sont présentés et discutés.
L’hypoxie peut être atteint de diverses façons, chacune produisant un niveau différent d’O2. Ici, l’hypoxie a été créée par coulant continuellement ultra haute pureté N2 dans les fioles, qui abaisse [O2] dissous immédiatement avec des cinétiques reproductibles 10. Il est possible qu’il y a quelques O2 molécules qui contribuent au métabolisme et l’expression génique mais cet environnement est considéré comme très proche d’anaérobie. En l’absence d’O2, cellules de levure ne peuvent biosynthétiser hème, ergostérol et acides gras insaturés 4,12,14. Ainsi, des études antérieures ont inclus ces métabolites dans la culture de levure sans oxygène 5,10,15. Cependant, les nombreuses réponses hypoxiques sont médiés par l’épuisement de ces métabolites et ainsi reconstituer les renverse le gène hypoxique expression réponses 12,16. Afin d’imiter l’hypoxie naturel, ces métabolites n’ont pas été ajoutés à la presse. Le temps que les cellules ont été exposées à une hypoxie sans la présence de ces métabolites essentiels, il n’y avait aucune augmentation notable de la mort cellulaire (données non présentées), ni un stress prolongé réponse 13.
La réponse est également dépendante de la souche et son génotype. Les allèles des régulateurs connus des réponses hypoxiques 2sont particulièrement importants. L’arrière-plan de souche S288C est hautement souhaitée afin que les résultats peuvent être comparés aux autres études génomiques effectuées avec cette souche. Cependant, S288C contient un allèle de perte de fonction partiel des HAP1 gène 17, un régulateur transcriptionnel critique pour la réponse à l’hypoxie. Cet allèle a été réparé en S288C à l’aide d’un type sauvage la copie de la Σ1278b souche fond 11.
L’expression des gènes dépend fortement de l’environnement cellulaire. Ainsi, lorsque vous effectuez l’analyse d’ADN messagère de Génome-large, il est important de maintenir un environnement constant tout en variant d’un autre paramètre comme temps, relance ou génotype. Pour obtenir des résultats très reproductibles, considérer ces trois pratiques pour l’étude et tous ses réplicats biologiques ou techniques. Tout d’abord, la même experimenter(s) doit réaliser l’étude, étant donné que les pratiques techniques peuvent varient selon les expérimentateurs. En second lieu, le même lot d’ingrédients devrait servir dans les milieux de culture chaque lot a une composition légèrement différente qui peut affecter l’expression des gènes. Troisièmement, pour minimiser les effets du cycle cellulaire, chaque instant doit provenir des cellules asynchrones dans la phase logarithmique de croissance (1-2 x 107 cellules/mL).
Lorsque caractérisant une réponse complexe comme la réponse d’expression de gène à l’hypoxie, une évolution temporelle est avantageuse pour la détermination de la cinétique de divers événements. Des moments spécifiques doivent être choisis qui saisiront les changements majeurs de la réponse. Dans cette étude, les points dans le temps entre 0 et 4 h ont été observées, parce que les expériences passées ont révélé des changements très répandues dans l’expression des gènes au cours de cette période, 13.
Pour mesurer l’expression génétique global, RNA-seq a été utilisé 18,19. Cette méthode utilise le séquençage de prochaine génération pour déterminer l’abondance relative de transcription de chaque gène. Par rapport à l’analyse ADN microarray, RNA-seq présente une sensibilité plus élevée (pour détecter les transcriptions moins abondantes), une plus grande gamme dynamique (pour mesurer des changements plus importants le pli) et une reproductibilité supérieure (à fidèlement suivre l’expression des gènes au fil du temps). En règle générale, l’ARN cellulaire plus est ARN ribosomique tant de méthodes ont été développées afin d’enrichir pour spécifique RNA espèces 20. Ici, les perles de poly-T ont été utilisés pour purifier transcriptions d’ARNm contenant du poly-A, bien que les différents dans le commerce – kits de déplétion des ARNr disponibles pourraient également être efficaces pour l’enrichissement de l’ARNm.
Ici, la réponse d’expression de gène de S. cerevisiae à l’hypoxie a été caractérisée. Les cellules ont été exposés à une hypoxie et puis échantillonnés à huit points dans le temps (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180 et 240 min). Pour confirmer la reproductibilité et de définir les transcriptions statistiquement modifiées, trois réplicats biologiques ont été effectuées. ARN a été extrait par rupture mécanique et de la purification de la colonne et ensuite traitée pour l’analyse de la RNA-seq. Le pipeline après séquençage est décrit et scripts de programmation sont fournies qui permettent la réplication exacte des analyses effectuées. Plus précisément, Trimmomatic 21, TopHat2 22, HTseq 23, l’environnement statistique R 24et le DESeq2 le paquet de 25 ont été utilisés pour traiter les données de RNA-seq et d’identifier des 607 gènes qui changent de façon significative au cours de hypoxie. Analyse en composantes principales (ACP) et l’expression génique des répliques, a indiqué la reproductibilité de la technique. Clustering et heatmaps révèle cinétique d’expression de grande envergure, tandis que gene ontology (aller) analyse a montré que de nombreux processus cellulaires, comme la respiration aérobie, sont enrichis dans l’ensemble des gènes régulés par l’oxygène.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette étude, les taux d’ARNm pour tous les gènes a été mesurée au cours de l’hypoxie dans la levure S. cerevisiae. Le but était d’analyser les modifications de l’expression génique comment global en raison de la croissance dans un environnement contrôlé de près-anoxiques. Plusieurs mesures ont été prises pour s’assurer que la méthode décrite ici a été soigneusement contrôlées et reproductibles. Tout d’abord, les cellules sont exposées à un milieu hypoxique précisément défi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions l’Institut Lewis-Sigler Integrative Genomics séquençage Core Facility à l’Université de Princeton pour des conseils techniques et séquençage et préparation de bibliothèque d’ARN. Ce travail a été soutenu par des subventions de l’Université Rowan et NIH NIGM R15GM113187 à M.J.H.
Materials
| Enclosed dry incubator | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | Set at 30°C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures. |
| Micro-analysis Filter Holder | Millipore | XX1002530 | 25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125mL filtering flask |
| Strong vacuum | Edwards | E-LAB 2 | The “house” vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here. |
| 1000-mL flask | To act as vacuum trap. | ||
| ~2-foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in | Tygon | 38TT | Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system. |
| High-pressure N2 gas tank | 99.999% purity, >1000psi, with a regulator and gas flow controller | ||
| Autoclaved 500mL flask | Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain. | ||
| Autoclaved 250mL flasks | Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps. | ||
| Flask stoppers (size 6, two holes with 5mm diameter) | Sterilized with 70% ethanol. One for each flask. | ||
| Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm | Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes. | ||
| ~25-cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm | Tygon | E-3603 | One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol. |
| Sterile filter discs | Millipore | HAWP02500 | 25mm diameter, 0.45 µm pore size, one for each time point |
| Sterile dH2O (~100mL) | |||
| 1-mL cuvettes | For measuring OD600 (i.e., cell concentration) | ||
| 50-mL sterile centrifuge tubes | One for each time point | ||
| Clean and sterile tweezers | |||
| liquid nitrogen | For freezing cells | ||
| acid-washed beads | Sigma | G8772 | Keep at 4°C for lysing cells |
| Qiagen RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For RNA column purification |
| Qiagen RLT buffer | Prepare by adding 10µL of β-Mercaptoethanol per 1mL of RLT buffer, keep at 4C. | ||
| 2-mL collection tubes | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RPE | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RW1 | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| DNase I stock and working solutions | Qiagen | 79254 | The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550µL of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20°C) in single-use aliquots (80µL each). The stock solution should not be thawed and refrozen. |
| Buffer RDD | Qiagen | included in the Qiagen DNase Kit | |
| Ice cold 2-mL screw-cap tubes | For lysing cells during RNA extraction | ||
| bead mill homogenizer | Biospec Mini-Beadbeater-24 | 112011 | Keep in cold room |
| Bacto Peptone | BD | DF0118 | for liquid YPD media |
| Bacto Yeast Extract | BD | DF0886 | for liquid YPD media |
| glucose | Fisher | D16 | for liquid YPD media |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher | Q32856 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fisher | Q32853 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM RNA Assay Kit | Thermo Fisher | Q32855 | for measuring nucleic acid concentration |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | for measuring nucleic acid concentration |
| Commercial electrophoresis system | Agilent | Bioanalyzer 2100 | for measuring nucleic acid quality |
| Next-generation sequencer | Illumina | HiSeq 2500 | for sequencing libraries |
| automated liquid handling system | Wafergen | Apollo 324 | for creating sequencing libraries |
| PrepX PolyA mRNA Isolation Kit | Wafergen | 400047 | for isolating mRNA from total RNA |
| PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit | Wafergen | 400039 | for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA |
| Barcode Splitter | https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d | ||
| Samtools, which includes the gzip command | http://www.htslib.org/download/ | ||
| Trimmomatic | http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | ||
| Bowtie2 (installed before TopHat) | http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | ||
| TopHat | https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml | ||
| HTSeq | http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html | ||
| R (installed before R Studio) | https://cran.rstudio.com | ||
| R Studio (free version) | https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
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