Måle mRNA nivåer Over tid under gjær S. cerevisiae Hypoxic svaret
Summary
Her presenterer vi en protokollen ved hjelp av RNA-seq overvåke mRNA nivåer over tid under hypoxic svaret S. cerevisiae celler. Denne metoden kan tilpasses til å analysere genuttrykk under en cellulær respons.
Abstract
Omfattende endringer i genuttrykk megle vanligvis en stor del av en cellulær respons. Hver genet kan endre uttrykk med unike kinetics genet er regulert av bestemt tidspunktet for en av mange stimuli, signalnettverk trasé eller sekundære effekter. For å fange opp hele genet ble uttrykk svar hypoksi i gjær S. cerevisiae, RNA-seq analyse brukt til å overvåke mRNA nivåene av alle gener til bestemte tider etter eksponering for hypoksi. Hypoksi ble etablert av voksende celler i ~ 100% N2 gass. Viktigere, i motsetning til andre hypoxic studier, ble ergosterol og umettede fettsyrer ikke lagt til media fordi disse metabolitter påvirker genuttrykk. Tidspunkt ble valgt i området 0 – 4 h etter hypoksi fordi denne perioden fanger opp de store endringene i genuttrykk. På hvert punkt, midt Logg hypoxic celler var raskt filtrert og frosset, begrense eksponering for O2 og samtidig endringer i genuttrykk. Totalt RNA ble Hentet fra celler og brukes til å berike for mRNA, som ble deretter konvertert til cDNA. Fra denne cDNA, multiplex biblioteker ble opprettet og åtte eller mer ble sekvensert i ett kjørefelt av en neste generasjons sequencer. En post sekvensering rørledning er beskrevet, som inkluderer kvalitet base trimming, lese kartlegging og bestemme antall leser per genet. DESeq2 i R statistiske miljøet ble brukt til å identifisere tilblivelse det endres vesentlig på ett av punktene hypoxic tid. Analyse av tre biologiske replikat viste høy reproduserbarhet, gener av ulike kinetics og mange forventet O2-regulert gener. Disse metodene kan brukes til å studere hvordan cellene av ulike organismer reagerer hypoksi over tid og tilpasset for å studere genuttrykk under andre cellulære svar.
Introduction
Mange organismer svare hypoksi eller lav O2, ved å endre gene expression 1,2,3. Dette svaret hjelper celler håndtere mangelen på et substrat kritisk for aerobic åndedrett og flere biosyntetiske reaksjoner, men også med en skiftende redoks staten 4. Flere microarray studier utført i S. cerevisiae viser at mRNA nivåene av hundrevis av gener endre svar hypoksi 5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. nylig RNA-seq ble brukt til å karakterisere gene expression endringer over tid i hypoksi 13. Her, eksperimentelle detaljene blir presentert og drøftet.
Hypoksi kan oppnås på ulike måter, hver produserer et annet nivå av O2. Her, hypoksi ble etablert av kontinuerlig flyt ultra høy renhetsgrad N2 i flasker, som senker [O2] oppløst umiddelbart med reproduserbar kinetics 10. Det er mulig at det er noen O2 molekyler tilstede som bidrar til metabolisme og gene expression men dette miljøet anses svært nær anaerob. I fravær av O2, gjærceller ikke biosynthesize måltema, ergosterol og umettede fettsyrer 4,12,14. Tidligere studier har derfor tatt disse metabolitter som vokser gjær uten oksygen 5,10,15. Men mange hypoxic svar er formidlet av utarming av disse metabolitter og dermed fylle dem reverserer hypoxic gene expression svar 12,16. For å etterligne naturlig hypoksi, ble disse metabolitter ikke lagt til media. På kort tid at celler ble utsatt for hypoksi uten tilstedeværelse av disse viktige metabolitter, var det ingen merkbar økning i celledød (data ikke vist) eller en langvarig stress respons 13.
Svaret er også avhengig av belastningen og dens genotype. Spesielt viktig er alleler av kjente regulatorer hypoxic svar 2. S288C belastning bakgrunnen er svært ønskelig slik at resultatene kan sammenlignes med andre genomisk studier utført med denne belastningen. S288C inneholder imidlertid en delvis tap av funksjon allelet av i HAP1 gen 17, en transcriptional regulator som er kritiske for hypoxic respons. Denne allelet ble reparert i S288C bruker en wildtype Kopier fra Σ1278b press bakgrunn 11.
Genuttrykk er svært avhengig av mobilnettet miljø. Dermed når du utfører genomet hele mRNA analyse, er det viktig å opprettholde et konstant miljø mens varierende en annen parameter som tid, stimulans eller genotype. For å oppnå svært reproduserbar resultater, kan du vurdere disse tre metodene for studier og alle dens biologiske eller teknisk gjentak. Først skal den samme experimenter(s) utføre studien, siden tekniske praksis kan variere mellom forskere. Andre burde samme gruppe av ingredienser bli brukt i vekst medier for hver gruppe har en litt annen sammensetning som kan påvirke genuttrykk. Tredje, for å minimere celle syklus effekter, hvert punkt bør bestå av asynkrone celler i midten av Logg fasen av vekst (1-2 x 107 celler/mL).
Når karakterisere komplekse svar som gene expression svaret hypoksi, er en gang løpet fordelaktig for å bestemme the kinetics av ulike arrangementer. Bestemt tidspunkt bør velges som vil fange de store endringene av svaret. I denne studien ble tidspunkt mellom 0 og 4 h observert, fordi siste eksperimenter avdekket omfattende endringer i genuttrykk under denne perioden 13.
For å måle globale genuttrykk, var RNA-seq brukt 18,19. Denne metoden bruker neste generasjons sekvensering for å bestemme den relative overfloden av hver genet transkripsjon. Sammenlignet DNA microarray analyse, utstillinger RNA-seq høyere følsomhet (å oppdage mindre rikelig transkripsjoner), større dynamisk område (for å måle større fold endringer) og overlegen reproduserbarhet (å nøyaktig følge genuttrykk over tid). Mest mobilnettet RNA er vanligvis ribosomal RNA så mange metoder har blitt utviklet for å berike for bestemte RNA arter 20. Her, poly-T perler ble brukt til å rense poly-A-inneholder mRNA transkripsjoner, skjønt de ulike kommersielt – tilgjengelig rRNA uttømming kits kan også være effektiv i mRNA berikelse.
Her, var S. cerevisiae gene expression svaret hypoksi preget. Cellene ble utsatt for hypoksi og deretter samplet på åtte tidspunkt (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180 og 240 min). Bekrefte reproduserbarhet og identifisere statistisk endret transkripsjoner, ble tre biologiske gjentak utført. RNA ble hentet av mekanisk avbrudd og kolonnen rensing, og deretter behandlet for RNA-seq analyse. Etter sekvensering rørledningen er beskrevet og programmering skript er angitt som tillater nøyaktig replikering av analysene utført. Spesielt ble Trimmomatic 21, TopHat2 22, HTseq 23, R statistiske miljø 24og DESeq2 pakken 25 brukt til å behandle RNA-seq data og identifisere 607 gener som endres vesentlig i løpet hypoksi. Viktigste komponenten analyse (PCA) og genuttrykk av replikat angitt reproduserbarhet av teknikken. Klynger og heatmaps avdekket omfattende uttrykk kinetikk, mens gene ontologi (gå) analyse viste at mange mobilnettet prosesser som aerobic åndedrett, er beriket i settet med oksygen regulert gener.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne studien mRNA nivåene for alle gener ble målt under hypoksi i gjær S. cerevisiae. Målet var å analysere hvordan global gene expression endringer på grunn av veksten i et kontrollert nær-anoksisk miljø. Flere skritt ble tatt for å sikre at metoden beskrevet her var nøye kontrollert og reproduserbar. Først celler ble utsatt for et presist definert hypoxic miljø: 99,999% N2 i medierik (YPD). Andre studier av hypoksi har stengt kolbe eller tube til luft 32, bruke…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Lewis-Sigler Institutt for integrerende Genomics sekvensering Core anlegget ved Princeton University for teknisk rådgivning og RNA biblioteket forberedelse og sekvenser. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Rowan University og NIH NIGMS R15GM113187 til M.J.H.
Materials
| Enclosed dry incubator | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | Set at 30°C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures. |
| Micro-analysis Filter Holder | Millipore | XX1002530 | 25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125mL filtering flask |
| Strong vacuum | Edwards | E-LAB 2 | The “house” vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here. |
| 1000-mL flask | To act as vacuum trap. | ||
| ~2-foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in | Tygon | 38TT | Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system. |
| High-pressure N2 gas tank | 99.999% purity, >1000psi, with a regulator and gas flow controller | ||
| Autoclaved 500mL flask | Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain. | ||
| Autoclaved 250mL flasks | Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps. | ||
| Flask stoppers (size 6, two holes with 5mm diameter) | Sterilized with 70% ethanol. One for each flask. | ||
| Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm | Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes. | ||
| ~25-cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm | Tygon | E-3603 | One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol. |
| Sterile filter discs | Millipore | HAWP02500 | 25mm diameter, 0.45 µm pore size, one for each time point |
| Sterile dH2O (~100mL) | |||
| 1-mL cuvettes | For measuring OD600 (i.e., cell concentration) | ||
| 50-mL sterile centrifuge tubes | One for each time point | ||
| Clean and sterile tweezers | |||
| liquid nitrogen | For freezing cells | ||
| acid-washed beads | Sigma | G8772 | Keep at 4°C for lysing cells |
| Qiagen RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For RNA column purification |
| Qiagen RLT buffer | Prepare by adding 10µL of β-Mercaptoethanol per 1mL of RLT buffer, keep at 4C. | ||
| 2-mL collection tubes | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RPE | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RW1 | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| DNase I stock and working solutions | Qiagen | 79254 | The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550µL of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20°C) in single-use aliquots (80µL each). The stock solution should not be thawed and refrozen. |
| Buffer RDD | Qiagen | included in the Qiagen DNase Kit | |
| Ice cold 2-mL screw-cap tubes | For lysing cells during RNA extraction | ||
| bead mill homogenizer | Biospec Mini-Beadbeater-24 | 112011 | Keep in cold room |
| Bacto Peptone | BD | DF0118 | for liquid YPD media |
| Bacto Yeast Extract | BD | DF0886 | for liquid YPD media |
| glucose | Fisher | D16 | for liquid YPD media |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher | Q32856 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fisher | Q32853 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM RNA Assay Kit | Thermo Fisher | Q32855 | for measuring nucleic acid concentration |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | for measuring nucleic acid concentration |
| Commercial electrophoresis system | Agilent | Bioanalyzer 2100 | for measuring nucleic acid quality |
| Next-generation sequencer | Illumina | HiSeq 2500 | for sequencing libraries |
| automated liquid handling system | Wafergen | Apollo 324 | for creating sequencing libraries |
| PrepX PolyA mRNA Isolation Kit | Wafergen | 400047 | for isolating mRNA from total RNA |
| PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit | Wafergen | 400039 | for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA |
| Barcode Splitter | https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d | ||
| Samtools, which includes the gzip command | http://www.htslib.org/download/ | ||
| Trimmomatic | http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | ||
| Bowtie2 (installed before TopHat) | http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | ||
| TopHat | https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml | ||
| HTSeq | http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html | ||
| R (installed before R Studio) | https://cran.rstudio.com | ||
| R Studio (free version) | https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
Referências
- Semenza, G. L. Oxygen sensing, homeostasis, and disease. New Eng. J Med. 365 (6), 537-547 (2011).
- Butler, G. Hypoxia and gene expression in eukaryotic microbes. Annu. Rev. Micro. 67, 291-312 (2013).
- Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing and hypoxia signalling pathways in animals: the implications of physiology for cancer. J. Physiol. 591 (Pt 8), 2027-2042 (2013).
- Rosenfeld, E., Beauvoit, B. Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen bySaccharomyces cerevisiae. Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).
- Ter Linde, J. J., et al. Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 181 (24), 7409-7413 (1999).
- Ter Linde, J. J., Steensma, H. Y. A microarray-assisted screen for potential Hap1 and Rox1 target genes in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 19 (10), 825-840 (2002).
- Kwast, K. E., et al. Genomic analyses of anaerobically induced genes in Saccharomyces cerevisiae: functional roles of Rox1 and other factors in mediating the anoxic response. J. Bacteriol. 184 (1), 250-265 (2002).
- Becerra, M., et al. The yeast transcriptome in aerobic and hypoxic conditions: effects of hap1, rox1, rox3 and srb10 deletions. Mol. Microbiol. 43 (3), 545-555 (2002).
- Lai, L. -. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Dynamical remodeling of the transcriptome during short-term anaerobiosis in Saccharomyces cerevisiae: differential response and role of Msn2 and/or Msn4 and other factors in galactose and glucose media. Mol. Cell. Biol. 25 (10), 4075-4091 (2005).
- Lai, L. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Metabolic-State-Dependent Remodeling of the Transcriptome in Response to Anoxia and Subsequent Reoxygenation in Saccharomyces cerevisiae. Euk. Cell. 5 (9), 1468-1489 (2006).
- Hickman, M. J., Winston, F. Heme levels switch the function of Hap1 of Saccharomyces cerevisiae between transcriptional activator and transcriptional repressor. Mol. Cell. Biol. 27 (21), 7414-7424 (2007).
- Hickman, M. J., Spatt, D., Winston, F. The Hog1 mitogen-activated protein kinase mediates a hypoxic response in Saccharomyces cerevisiae. Genética. 188 (2), 325-338 (2011).
- Bendjilali, N., et al. Time-Course Analysis of Gene Expression During the Saccharomyces cerevisiae Hypoxic Response. G3. 7 (1), 221-231 (2017).
- Chellappa, R., et al. The membrane proteins, Spt23p and Mga2p, play distinct roles in the activation of Saccharomyces cerevisiae OLE1 gene expression. Fatty acid-mediated regulation of Mga2p activity is independent of its proteolytic processing into a soluble transcription activator. J. Biol. Chem. 276 (47), 43548-43556 (2001).
- Abramova, N. E., et al. Regulatory mechanisms controlling expression of the DAN/TIR mannoprotein genes during anaerobic remodeling of the cell wall in Saccharomyces cerevisiae. Genética. 157 (3), 1169-1177 (2001).
- Hughes, A. L., Todd, B. L., Espenshade, P. J. SREBP Pathway Responds to Sterols and Functions as an Oxygen Sensor in Fission Yeast. Cell. 120 (6), 831-842 (2005).
- Gaisne, M., Bécam, A. M., Verdière, J., Herbert, C. J. A "natural" mutation in Saccharomyces cerevisiae strains derived from S288c affects the complex regulatory gene HAP1 (CYP1). Curr. Gen. 36 (4), 195-200 (1999).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Gen. 10 (1), 57-63 (2009).
- Anders, S., Huber, W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol. 11 (10), R106 (2010).
- Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biol. 17 (1), 13 (2016).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq–A Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinf. 31 (2), 166-169 (2015).
- . R: A Language and Environment for Statistical Computing Available from: https://www.R-project.org (2015)
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- Brown, T., Mackey, K., Du, T. Analysis of RNA by Northern and Slot Blot Hybridization. Curr. Prot. Mol. Biol. 74, 4.9.1-4.9.19 (2004).
- Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nuc. Acids Res. 30 (1), 207-210 (2002).
- Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nuc. Acids Res. 40, D700-D705 (2012).
- Hothorn, T., Everitt, B. S. . A Handbook of Statistical Analyses using R. , (2014).
- Saldanha, A. J. Java Treeview–extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
- Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Nat. Acad. Sci. 95 (25), 14863-14868 (1998).
- Davies, B. S. J., Rine, J. A Role for Sterol Levels in Oxygen Sensing in Saccharomyces cerevisiae. Genética. 174 (1), 191-201 (2006).
- Meena, R. C., Kumar, N., Nath, S., Chakrabarti, A. Homologous Recombination is Activated at Early Time Points Following Exposure to Cobalt Chloride Induced Hypoxic Conditions in Saccharomyces cerevisiae. Ind. J. Microb. 52 (2), 209-214 (2012).
- Snoek, I. S. I., Tai, S. L., Pronk, J. T., Yde Steensma, H., Daran, J. -. M. Involvement of Snf7p and Rim101p in the transcriptional regulation of TIR1 and other anaerobically upregulated genes in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 10 (4), 367-384 (2010).
- Ellahi, A., Thurtle, D. M., Rine, J. The Chromatin and Transcriptional Landscape of Native Saccharomyces cerevisiae Telomeres and Subtelomeric Domains. Genética. 200 (2), 505-521 (2015).
- Collart, M. A., Oliviero, S., et al. Preparation of yeast RNA. Curr. Prot. Mol. Biol. , (2001).
- Blankenberg, D., et al. Manipulation of FASTQ data with Galaxy. Bioinf. 24 (14), 1783-1785 (2010).
- Martini, P., et al. timeClip: pathway analysis for time course data without replicates. BMC Bioinf. 15, (2014).
- Oh, S., Song, S., Grabowski, G., Zhao, H., Noonan, J. P. Time series expression analyses using RNA-seq: a statistical approach. BioMed Res. Int. 2013, 1-16 (2013).
