Medición de los niveles de mRNA con el tiempo durante la levadura S. cerevisiae por respuesta hipóxica
Summary
Aquí, presentamos un protocolo usando RNA-seq para controlar los niveles de mRNA con el tiempo durante la respuesta hipóxica de las células de S. cerevisiae . Este método puede adaptarse para analizar la expresión génica durante cualquier respuesta celular.
Abstract
Complejos cambios en la expresión génica normalmente median una gran parte de la respuesta celular. Cada gen puede cambiar la expresión cinética única como el gen es regulado por el calendario particular de uno de los muchos estímulos, señalización de vías o efectos secundarios. Para capturar el gene entero de expresión ante la hipoxia en la levadura S. cerevisiae, RNA-seq análisis fue utilizada para supervisar los niveles de mRNA de los genes en momentos específicos después de la exposición a la hipoxia. Hipoxia fue establecida por cultivo de células en ~ 100% N2 gas. Lo importante, a diferencia de otros estudios hipóxicos, ergosterol y ácidos grasos insaturados no agregaron a los medios de comunicación ya que estos metabolitos afectan la expresión génica. Puntos de tiempo fueron elegidos en el intervalo de 0 – 4 h después de la hipoxia porque ese período captura los principales cambios en la expresión génica. En cada momento, las células hipóxicas registros medio fueron rápidamente filtrado y congelado, limitar la exposición a los cambios2 y concomitante O en la expresión génica. ARN total fue extraído de las células y utilizado para enriquecer de mRNA, que luego se convierte a cDNA. De este cDNA, se crearon bibliotecas multiplexores y ocho o más muestras se secuenciaron en un carril de un secuenciador de última generación. Una tubería de la secuencia se describe, que incluye ajuste de base de calidad, leer cartografía y determinar el número de lecturas por gene. DESeq2 en el ambiente estadístico de R fue utilizado para identificar los genes que cambian significativamente en alguno de los puntos del tiempo hipóxico. El análisis de tres réplicas biológicas reveló alta reproducibilidad, genes de diferenciación cinética y un gran número de esperan O2-regulada de los genes. Estos métodos pueden ser utilizados para estudiar cómo las células de diferentes organismos responden a la hipoxia con el tiempo y adaptados para el estudio de expresión génica durante otras respuestas celulares.
Introduction
Muchos organismos responden a la hipoxia, o baja O2, alterando gene expression 1,2,3. Esta respuesta ayuda a las células frente a la falta de un sustrato crítico para la respiración aeróbica y para varias reacciones biosintéticas, pero también con un cambio de estado de redox 4. Varios estudios de microarray en S. cerevisiae muestran que los niveles de mRNA de cientos de genes cambian en respuesta a hipoxia 5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. recientemente, RNA-seq fue utilizado para caracterizar cambios de expresión génica en el tiempo durante la hipoxia 13. Aquí, se presentan los detalles experimentales y discuten.
La hipoxia puede lograrse de varias maneras, cada una produciendo un nivel diferente de O2. Aquí, la hipoxia fue establecida por continuamente que fluye ultra alta pureza N2 en frascos, que disminuye [O2] inmediatamente disuelta con reproductivos cinética 10. Es posible que algunas O2 moléculas presentes que contribuyen a la expresión génica y el metabolismo pero este entorno se considera muy cerca de anaerobios. En ausencia de O2, las células de levadura no pueden sintetizar hemo, ergosterol y ácidos grasos insaturados 4,12,14. Así, estudios previos han incluido estos metabolitos cuando levadura sin oxígeno 5,10,15. Sin embargo, muchas respuestas hipóxicas son mediadas por el agotamiento de estos metabolitos y así rellenarlos invierte en el gen hipóxico expresión respuestas 12,16. Con el fin de imitar la hipoxia natural, estos metabolitos no fueron agregados a los medios de comunicación. En el poco tiempo que las células fueron expuestas a hipoxia sin la presencia de estos metabolitos esenciales, no había ningún aumento sensible en la muerte celular (datos no mostrados) ni a estrés prolongado respuesta 13.
La respuesta también es dependiente de la cepa y su genotipo. Especialmente importantes son los alelos de los reguladores conocidos de respuestas hipóxicas 2. El fondo de la cepa de S288C es altamente deseado para que resultados pueden ser comparados con los otros estudios genómicos realizados con esta variedad. Sin embargo, S288C contiene un alelo de pérdida de la función parcial de la HAP1 gen 17, un regulador transcripcional esencial para la respuesta hipóxica. Este alelo fue reparado en S288C usando un wildtype copia de la Σ1278b cepa fondo 11.
Expresión génica es altamente dependiente sobre el medio ambiente celular. Por lo tanto, al realizar el análisis del mRNA del genoma, es importante mantener un ambiente constante mientras varía otro parámetro como tiempo, estímulo o genotipo. Para lograr resultados altamente reproducibles, considere estas tres prácticas para el estudio y sus réplicas biológicas o técnicas. En primer lugar, el mismo experimenter(s) debe realizar el estudio, desde prácticas técnicas pueden variar a través de experimentadores. En segundo lugar, del mismo lote de ingredientes debe utilizarse en los medios de crecimiento, ya que cada lote tiene una composición ligeramente diferente que puede afectar la expresión génica. En tercer lugar, para minimizar los efectos del ciclo de la célula, cada momento debe consistir en células asincrónicas en la fase de registro medio de crecimiento (1-2 x 107 células/mL).
Al caracterizar una respuesta compleja como la gene expresión respuesta a la hipoxia, un curso del tiempo es ventajoso para la determinación de la cinética de varios eventos. Puntos de tiempo específico deben ser elegidos que capturará los principales cambios de la respuesta. En este estudio, se observaron puntos de tiempo entre 0 y 4 h, porque pasados experimentos revelaron cambios generalizados en la expresión génica durante este período 13.
Para medir la expresión génica global, RNA-seq fue usado 18,19. Este método utiliza secuenciación de próxima generación para determinar la abundancia relativa de transcripción de cada gen. En comparación con el análisis de microarrays de DNA, RNA-seq exhibe una mayor sensibilidad (para detectar menos abundantes transcripciones), un mayor rango dinámico (para medir cambios veces mayor) y reproducibilidad superior (seguir con precisión la expresión génica en el tiempo). Normalmente, más celular ARN es ARN ribosómico que muchos métodos han sido desarrollados para enriquecer determinados RNA especie 20. Aquí, granos de poly-T se utilizaron para purificar las transcripciones del mRNA de la poli-que la contengan, aunque varios comercialmente – kits disponibles de agotamiento de rRNA también podrían ser eficaces en el enriquecimiento de mRNA.
Aquí, se caracterizó la respuesta de expresión del gen de S. cerevisiae a la hipoxia. Las células fueron expuestas a la hipoxia y luego muestras en ocho puntos del tiempo (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180 y 240 min). Para confirmar la reproducibilidad e identificar estadísticamente cambió las transcripciones, se realizaron tres réplicas biológicas. ARN fue extraído por la interrupción mecánica y purificación de la columna y luego procesada para el análisis de RNA-seq. Se describe la tubería posterior secuenciación y programación scripts son siempre que permiten la replicación exacta de los análisis realizados. Específicamente, Trimmomatic 21TopHat2 22, HTseq 23, el entorno estadístico de R 24y el DESeq2 paquete 25 fueron utilizados para procesar los datos de RNA-seq y a identificar los 607 genes que cambian significativamente durante hipoxia. Análisis de componentes principales (PCA) y expresión génica de las repeticiones indican la reproducibilidad de la técnica. Clustering y heatmaps reveló cinética de expresión amplia, mientras que el análisis del gene ontology (GO) demostró que muchos procesos celulares, como respiración aeróbica, se enriquecen en el conjunto de genes regulados por el oxígeno.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, se midió los niveles de mRNA de los genes durante la hipoxia en la levadura S. cerevisiae. El objetivo era analizar cómo global gene expresión cambios debido al crecimiento en un entorno controlado cerca-anóxica. Varias medidas fueron tomadas para asegurar que el método descrito aquí fue cuidadosamente controlada y reproducible. En primer lugar, las células fueron expuestas a un ambiente hipóxico precisamente definido: 99.999% N2 en medios enriquecidos (YPD). Otros estudios de…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos el Instituto Lewis Sigler integradora genómica instalaciones centrales para secuenciación en la Universidad de Princeton para asesoramiento técnico y preparación de biblioteca de RNA y secuenciación. Este trabajo fue financiado por becas de la Universidad de Rowan y NIH NIGMS R15GM113187 a M.J.H.
Materials
| Enclosed dry incubator | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | Set at 30°C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures. |
| Micro-analysis Filter Holder | Millipore | XX1002530 | 25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125mL filtering flask |
| Strong vacuum | Edwards | E-LAB 2 | The “house” vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here. |
| 1000-mL flask | To act as vacuum trap. | ||
| ~2-foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in | Tygon | 38TT | Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system. |
| High-pressure N2 gas tank | 99.999% purity, >1000psi, with a regulator and gas flow controller | ||
| Autoclaved 500mL flask | Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain. | ||
| Autoclaved 250mL flasks | Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps. | ||
| Flask stoppers (size 6, two holes with 5mm diameter) | Sterilized with 70% ethanol. One for each flask. | ||
| Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm | Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes. | ||
| ~25-cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm | Tygon | E-3603 | One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol. |
| Sterile filter discs | Millipore | HAWP02500 | 25mm diameter, 0.45 µm pore size, one for each time point |
| Sterile dH2O (~100mL) | |||
| 1-mL cuvettes | For measuring OD600 (i.e., cell concentration) | ||
| 50-mL sterile centrifuge tubes | One for each time point | ||
| Clean and sterile tweezers | |||
| liquid nitrogen | For freezing cells | ||
| acid-washed beads | Sigma | G8772 | Keep at 4°C for lysing cells |
| Qiagen RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For RNA column purification |
| Qiagen RLT buffer | Prepare by adding 10µL of β-Mercaptoethanol per 1mL of RLT buffer, keep at 4C. | ||
| 2-mL collection tubes | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RPE | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RW1 | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| DNase I stock and working solutions | Qiagen | 79254 | The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550µL of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20°C) in single-use aliquots (80µL each). The stock solution should not be thawed and refrozen. |
| Buffer RDD | Qiagen | included in the Qiagen DNase Kit | |
| Ice cold 2-mL screw-cap tubes | For lysing cells during RNA extraction | ||
| bead mill homogenizer | Biospec Mini-Beadbeater-24 | 112011 | Keep in cold room |
| Bacto Peptone | BD | DF0118 | for liquid YPD media |
| Bacto Yeast Extract | BD | DF0886 | for liquid YPD media |
| glucose | Fisher | D16 | for liquid YPD media |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher | Q32856 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fisher | Q32853 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM RNA Assay Kit | Thermo Fisher | Q32855 | for measuring nucleic acid concentration |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | for measuring nucleic acid concentration |
| Commercial electrophoresis system | Agilent | Bioanalyzer 2100 | for measuring nucleic acid quality |
| Next-generation sequencer | Illumina | HiSeq 2500 | for sequencing libraries |
| automated liquid handling system | Wafergen | Apollo 324 | for creating sequencing libraries |
| PrepX PolyA mRNA Isolation Kit | Wafergen | 400047 | for isolating mRNA from total RNA |
| PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit | Wafergen | 400039 | for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA |
| Barcode Splitter | https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d | ||
| Samtools, which includes the gzip command | http://www.htslib.org/download/ | ||
| Trimmomatic | http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | ||
| Bowtie2 (installed before TopHat) | http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | ||
| TopHat | https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml | ||
| HTSeq | http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html | ||
| R (installed before R Studio) | https://cran.rstudio.com | ||
| R Studio (free version) | https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
Referências
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