Mäta mRNA nivåer över tid under den jäst S. cerevisiae hypoxisk svar
Summary
Här presenterar vi ett protokoll som använder RNA-seq för att övervaka mRNA nivåer över tid under hypoxisk svaret från S. cerevisiae celler. Denna metod kan anpassas att analysera genuttryck under någon cellulära svar.
Abstract
Komplexa förändringar i genuttryck medla vanligtvis en stor del av ett cellulärt svar. Varje gen kan ändra uttryck med unika kinetik genen regleras av särskilda tidpunkten för en av många stimuli, signalering vägar eller sekundära effekter. För att fånga hela genen användes uttrycket svar till hypoxi i jästen S. cerevisiae, RNA-seq analys att övervaka de mRNA nivåerna av gener vid specifika tidpunkter efter exponering för hypoxi. Hypoxi grundades av växande celler i ~ 100% N2 gas. Ännu viktigare, till skillnad från andra hypoxisk studier, har ergosterol och omättade fettsyror inte lagts till media eftersom dessa metaboliter påverka genuttryck. Tidpunkter valdes i intervallet 0 – 4 h efter hypoxi eftersom den perioden fångar de stora förändringarna i genuttryck. Vid varje tidpunkt, mitten av log hypoxisk celler var snabbt filtreras och frysta, begränsa exponering för O2 och samtidig förändringar i genuttryck. Total-RNA var extraheras från celler och används för att berika för mRNA, som omvandlades sedan till cDNA. Från denna cDNA, multiplex bibliotek skapades och åtta eller fler prover var sekvenserade i ett körfält av en nästa generations sequencer. Efter sekvensering rörledning beskrivs, vilket inkluderar kvalitet bas trimning, Läs kartläggning och fastställande av antalet läsningar per genen. DESeq2 inom R statistiska miljön användes för att identifiera gener som förändras avsevärt vid någon av hypoxisk punkter. Analys av tre biologiska replikat visade hög reproducerbarhet, gener av olika kinetik och ett stort antal väntat O2-reglerade gener. Dessa metoder kan användas för att studera hur cellerna i olika organismer reagera på hypoxi över tid och anpassas för att studera genuttryck under andra cellulära svar.
Introduction
Många organismer reagera på hypoxi eller låg O2, genom att ändra gene expression 1,2,3. Detta svar hjälper celler klara med avsaknaden av ett substrat som är kritiska för aerob respiration och flera biosyntetiska reaktioner, men också med en föränderlig redox state 4. S. cerevisiae flera microarray studier visar att de mRNA nivåerna av hundratals gener ändra svar till hypoxi 5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. nyligen, RNA-seq användes att karakterisera gen uttryck förändringar över tid under hypoxi 13. Här, de experimentella detaljerna presenteras och diskuteras.
Hypoxi kan uppnås på olika sätt, varje producerar en annan nivå av O2. Här, hypoxi fastställdes genom att kontinuerligt flöda ultra-hög-renhet N-2 kolvar, vilket sänker [O2] upplöst omedelbart med reproducerbara kinetik 10. Det är möjligt att det finns vissa O2 molekyler närvarande som bidrar till ämnesomsättningen och genuttryck men denna miljö anses mycket nära anaeroba. I avsaknad av O2inte jästceller biosynthesize heme, ergosterol och omättade fettsyror 4,12,14. Således, tidigare studier har inkluderat dessa metaboliter när växer jäst utan syre 5,10,15. Men många hypoxisk svar medieras av utarmning av dessa metaboliter och således påfyllning dem vänder de hypoxiska gen uttryck Svaren 12,16. För att efterlikna naturliga hypoxi, har dessa metaboliter inte lagts till media. Under den korta tid att celler utsattes för hypoxi utan närvaro av dessa viktiga metaboliter, fanns det ingen märkbar ökning av celldöd (inga data anges) eller en långvarig stress svar 13.
Svaret är också beroende av belastningen och dess genotyp. Särskilt viktigt är allelerna av kända tillsynsmyndigheterna för hypoxisk Svaren 2. S288C stam bakgrunden är mycket önskvärt så att resultaten kan jämföras med de andra genetiska studier som utförts med denna stam. S288C innehåller emellertid en partiell förlust-av-funktion-allelen av HAP1 gen 17, en transkriptionell regulator som är kritiska för hypoxisk svar. Denna allel reparerades i S288C kopia från Σ1278b använda en vildtyp och sila bakgrunden 11.
Genuttryck är starkt beroende av den cellulära miljön. Därför, när du utför genome-wide mRNA analys, är det viktigt att upprätthålla en konstant miljö samtidigt varierande en annan parameter som tid, stimulans eller genotyp. För att uppnå mycket reproducerbara resultat, anser dessa tre metoder för att studera och alla dess biologiska eller tekniska replikat. Den samma experimenter(s) bör först, genomföra av studien, eftersom tekniska praxis kan variera över praktiker. För det andra, samma parti av ingredienser bör användas i tillväxt medier som varje parti har en något annorlunda sammansättning som kan påverka genuttryck. För det tredje, för att minimera cellcykeln effekter, varje tidpunkt bör bestå av asynkrona celler i mitten av log fas av tillväxt (1-2 x 107 celler/mL).
När karaktärisera en komplex reaktion som gen uttryck svaret till hypoxi, är en tid kurs fördelaktiga för fastställande av kineticsen av olika händelser. Specifika tidpunkter bör väljas som kommer att fånga de stora förändringarna av svar. I denna studie observerades tidpunkter mellan 0 och 4 h, eftersom tidigare experiment visade utbredda förändringar i genuttryck under denna period 13.
För att mäta globala genuttryck, var RNA-seq används 18,19. Denna metod använder nästa generations sekvensering för att avgöra det relativa överflödet av varje genens transkription. RNA-seq jämfört DNA microarray-analys, och uppvisar högre känslighet (för att upptäcka mindre riklig avskrifter), ett större dynamiskt omfång (att mäta större vik förändringar) och överlägsen reproducerbarhet (att noggrant följa genuttryck över tid). Den cellulära RNA är vanligtvis ribosomalt RNA så många metoder har utvecklats för att berika för specifika RNA arter 20. Här, poly-T pärlor användes att rena poly-A-innehållande mRNA avskrifter, men de olika kommersiellt – tillgängliga rRNA utarmning Kit kan också vara effektiva i mRNA anrikning.
Här präglades S. cerevisiae gen uttryck svaret till hypoxi. Cellerna var utsatt för hypoxi och sedan provtas vid åtta tidpunkter (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180 och 240 min). Att bekräfta reproducerbarhet och identifiera statistiskt ändrade avskrifter, utfördes tre biologiska replikat. RNA var extraheras av mekaniska störningar och kolumn rening och sedan bearbetas för RNA-seq analys. Rörledningen efter sekvensering beskrivs och programmering skript tillhandahålls som tillåter exakta replikering av analyserna som utförs. Specifikt, användes Trimmomatic 21, TopHat2 22, HTseq 23, R statistiska miljö 24och DESeq2 paketet 25 att bearbeta RNA-seq data och identifiera 607 gener som förändras avsevärt under hypoxi. Principalkomponentanalys (PCA) och genuttryck av replikerar den indikerade reproducerbarheten av tekniken. Kluster och heatmaps avslöjade omfattande uttryck kinetik, medan gen ontologi (gå) analysen visade att många cellulära processer, som aerob respiration, är berikad med uppsättningen syre-reglerade gener.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna studie mättes mRNA nivåer för alla gener under hypoxi i jästen S. cerevisiae. Målet var att analysera hur globala gen uttryck förändringar på grund av tillväxt i en kontrollerad nära-anoxiska miljö. Flera åtgärder har vidtagits för att säkerställa att den metod som beskrivs här var noggrant kontrollerade och reproducerbara. Det första celler utsattes för en exakt definierade hypoxiska miljö: 99,999% N2 i rika medier (YPD). Andra studier av hypoxi har stängt den kolven elle…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Lewis Sigler Institutet för integrativ genomik sekvensering Core Facility vid Princeton University för teknisk rådgivning och RNA bibliotek förberedelse och sekvensering. Detta arbete stöds av bidrag från Rowan University och NIH NIGMS R15GM113187 till M.J.H.
Materials
| Enclosed dry incubator | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | Set at 30°C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures. |
| Micro-analysis Filter Holder | Millipore | XX1002530 | 25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125mL filtering flask |
| Strong vacuum | Edwards | E-LAB 2 | The “house” vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here. |
| 1000-mL flask | To act as vacuum trap. | ||
| ~2-foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in | Tygon | 38TT | Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system. |
| High-pressure N2 gas tank | 99.999% purity, >1000psi, with a regulator and gas flow controller | ||
| Autoclaved 500mL flask | Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain. | ||
| Autoclaved 250mL flasks | Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps. | ||
| Flask stoppers (size 6, two holes with 5mm diameter) | Sterilized with 70% ethanol. One for each flask. | ||
| Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm | Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes. | ||
| ~25-cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm | Tygon | E-3603 | One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol. |
| Sterile filter discs | Millipore | HAWP02500 | 25mm diameter, 0.45 µm pore size, one for each time point |
| Sterile dH2O (~100mL) | |||
| 1-mL cuvettes | For measuring OD600 (i.e., cell concentration) | ||
| 50-mL sterile centrifuge tubes | One for each time point | ||
| Clean and sterile tweezers | |||
| liquid nitrogen | For freezing cells | ||
| acid-washed beads | Sigma | G8772 | Keep at 4°C for lysing cells |
| Qiagen RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For RNA column purification |
| Qiagen RLT buffer | Prepare by adding 10µL of β-Mercaptoethanol per 1mL of RLT buffer, keep at 4C. | ||
| 2-mL collection tubes | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RPE | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RW1 | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| DNase I stock and working solutions | Qiagen | 79254 | The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550µL of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20°C) in single-use aliquots (80µL each). The stock solution should not be thawed and refrozen. |
| Buffer RDD | Qiagen | included in the Qiagen DNase Kit | |
| Ice cold 2-mL screw-cap tubes | For lysing cells during RNA extraction | ||
| bead mill homogenizer | Biospec Mini-Beadbeater-24 | 112011 | Keep in cold room |
| Bacto Peptone | BD | DF0118 | for liquid YPD media |
| Bacto Yeast Extract | BD | DF0886 | for liquid YPD media |
| glucose | Fisher | D16 | for liquid YPD media |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher | Q32856 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fisher | Q32853 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM RNA Assay Kit | Thermo Fisher | Q32855 | for measuring nucleic acid concentration |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | for measuring nucleic acid concentration |
| Commercial electrophoresis system | Agilent | Bioanalyzer 2100 | for measuring nucleic acid quality |
| Next-generation sequencer | Illumina | HiSeq 2500 | for sequencing libraries |
| automated liquid handling system | Wafergen | Apollo 324 | for creating sequencing libraries |
| PrepX PolyA mRNA Isolation Kit | Wafergen | 400047 | for isolating mRNA from total RNA |
| PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit | Wafergen | 400039 | for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA |
| Barcode Splitter | https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d | ||
| Samtools, which includes the gzip command | http://www.htslib.org/download/ | ||
| Trimmomatic | http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | ||
| Bowtie2 (installed before TopHat) | http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | ||
| TopHat | https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml | ||
| HTSeq | http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html | ||
| R (installed before R Studio) | https://cran.rstudio.com | ||
| R Studio (free version) | https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
Referências
- Semenza, G. L. Oxygen sensing, homeostasis, and disease. New Eng. J Med. 365 (6), 537-547 (2011).
- Butler, G. Hypoxia and gene expression in eukaryotic microbes. Annu. Rev. Micro. 67, 291-312 (2013).
- Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing and hypoxia signalling pathways in animals: the implications of physiology for cancer. J. Physiol. 591 (Pt 8), 2027-2042 (2013).
- Rosenfeld, E., Beauvoit, B. Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen bySaccharomyces cerevisiae. Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).
- Ter Linde, J. J., et al. Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 181 (24), 7409-7413 (1999).
- Ter Linde, J. J., Steensma, H. Y. A microarray-assisted screen for potential Hap1 and Rox1 target genes in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 19 (10), 825-840 (2002).
- Kwast, K. E., et al. Genomic analyses of anaerobically induced genes in Saccharomyces cerevisiae: functional roles of Rox1 and other factors in mediating the anoxic response. J. Bacteriol. 184 (1), 250-265 (2002).
- Becerra, M., et al. The yeast transcriptome in aerobic and hypoxic conditions: effects of hap1, rox1, rox3 and srb10 deletions. Mol. Microbiol. 43 (3), 545-555 (2002).
- Lai, L. -. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Dynamical remodeling of the transcriptome during short-term anaerobiosis in Saccharomyces cerevisiae: differential response and role of Msn2 and/or Msn4 and other factors in galactose and glucose media. Mol. Cell. Biol. 25 (10), 4075-4091 (2005).
- Lai, L. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Metabolic-State-Dependent Remodeling of the Transcriptome in Response to Anoxia and Subsequent Reoxygenation in Saccharomyces cerevisiae. Euk. Cell. 5 (9), 1468-1489 (2006).
- Hickman, M. J., Winston, F. Heme levels switch the function of Hap1 of Saccharomyces cerevisiae between transcriptional activator and transcriptional repressor. Mol. Cell. Biol. 27 (21), 7414-7424 (2007).
- Hickman, M. J., Spatt, D., Winston, F. The Hog1 mitogen-activated protein kinase mediates a hypoxic response in Saccharomyces cerevisiae. Genética. 188 (2), 325-338 (2011).
- Bendjilali, N., et al. Time-Course Analysis of Gene Expression During the Saccharomyces cerevisiae Hypoxic Response. G3. 7 (1), 221-231 (2017).
- Chellappa, R., et al. The membrane proteins, Spt23p and Mga2p, play distinct roles in the activation of Saccharomyces cerevisiae OLE1 gene expression. Fatty acid-mediated regulation of Mga2p activity is independent of its proteolytic processing into a soluble transcription activator. J. Biol. Chem. 276 (47), 43548-43556 (2001).
- Abramova, N. E., et al. Regulatory mechanisms controlling expression of the DAN/TIR mannoprotein genes during anaerobic remodeling of the cell wall in Saccharomyces cerevisiae. Genética. 157 (3), 1169-1177 (2001).
- Hughes, A. L., Todd, B. L., Espenshade, P. J. SREBP Pathway Responds to Sterols and Functions as an Oxygen Sensor in Fission Yeast. Cell. 120 (6), 831-842 (2005).
- Gaisne, M., Bécam, A. M., Verdière, J., Herbert, C. J. A "natural" mutation in Saccharomyces cerevisiae strains derived from S288c affects the complex regulatory gene HAP1 (CYP1). Curr. Gen. 36 (4), 195-200 (1999).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Gen. 10 (1), 57-63 (2009).
- Anders, S., Huber, W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol. 11 (10), R106 (2010).
- Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biol. 17 (1), 13 (2016).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq–A Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinf. 31 (2), 166-169 (2015).
- . R: A Language and Environment for Statistical Computing Available from: https://www.R-project.org (2015)
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- Brown, T., Mackey, K., Du, T. Analysis of RNA by Northern and Slot Blot Hybridization. Curr. Prot. Mol. Biol. 74, 4.9.1-4.9.19 (2004).
- Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nuc. Acids Res. 30 (1), 207-210 (2002).
- Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nuc. Acids Res. 40, D700-D705 (2012).
- Hothorn, T., Everitt, B. S. . A Handbook of Statistical Analyses using R. , (2014).
- Saldanha, A. J. Java Treeview–extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
- Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Nat. Acad. Sci. 95 (25), 14863-14868 (1998).
- Davies, B. S. J., Rine, J. A Role for Sterol Levels in Oxygen Sensing in Saccharomyces cerevisiae. Genética. 174 (1), 191-201 (2006).
- Meena, R. C., Kumar, N., Nath, S., Chakrabarti, A. Homologous Recombination is Activated at Early Time Points Following Exposure to Cobalt Chloride Induced Hypoxic Conditions in Saccharomyces cerevisiae. Ind. J. Microb. 52 (2), 209-214 (2012).
- Snoek, I. S. I., Tai, S. L., Pronk, J. T., Yde Steensma, H., Daran, J. -. M. Involvement of Snf7p and Rim101p in the transcriptional regulation of TIR1 and other anaerobically upregulated genes in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 10 (4), 367-384 (2010).
- Ellahi, A., Thurtle, D. M., Rine, J. The Chromatin and Transcriptional Landscape of Native Saccharomyces cerevisiae Telomeres and Subtelomeric Domains. Genética. 200 (2), 505-521 (2015).
- Collart, M. A., Oliviero, S., et al. Preparation of yeast RNA. Curr. Prot. Mol. Biol. , (2001).
- Blankenberg, D., et al. Manipulation of FASTQ data with Galaxy. Bioinf. 24 (14), 1783-1785 (2010).
- Martini, P., et al. timeClip: pathway analysis for time course data without replicates. BMC Bioinf. 15, (2014).
- Oh, S., Song, S., Grabowski, G., Zhao, H., Noonan, J. P. Time series expression analyses using RNA-seq: a statistical approach. BioMed Res. Int. 2013, 1-16 (2013).
