S の酵母酵母の低酸素応答中に時間をかけての mRNA のレベルを測定
Summary
ここでは、RNA シーケンスを使用して酵母細胞の低酸素応答中に時間をかけての mRNA のレベルを監視するプロトコルを提案する.このメソッドは、任意の携帯電話応答中に遺伝子発現を解析する合わせることができます。
Abstract
遺伝子発現の複雑な変化は通常大部分の細胞応答を仲介します。各遺伝子は、遺伝子は多くの刺激、信号経路または二次的な影響の 1 つの特定のタイミングで規制されて、ユニークな反応速度で式を変更可能性があります。全体の遺伝子をキャプチャするために酵母、RNA シーケンス解析における低酸素応答は低酸素への露出の後の特定の時間にすべての遺伝子の mRNA のレベルを監視する使用されました。低酸素症は、〜 100% N2ガス細胞の成長によって設立されました。重要なは、その他の低酸素の研究とは異なりエルゴステ ロール、不飽和脂肪酸に追加されませんでしたメディアこれら代謝遺伝子発現に影響を与えるため。その期間は遺伝子発現に大きな変化をキャプチャするため、タイム ポイントは 0 – 低酸素後 4 h の範囲に選ばれました。各時点で中間ログ低酸素細胞がすぐにフィルタ リングされ、凍結、遺伝子発現の O2と併用変更への露出を制限します。総 RNA は細胞から抽出され、cDNA に変えられたし、mrna を豊かにするために使用します。この cDNA から多重ライブラリが作成された、8 個以上のサンプルが次世代シーケンサーの 1 つの車線に配列されました。マッピングと遺伝子ごとの読み取り数を決定する品質基本トリミングを含むポスト シーケンス処理パイプラインを説明します。R 統計環境の中で DESeq2 は、低酸素時点のいずれかで大きく変化する遺伝子を識別するために使用されました。3 生物的複製の分析は、高い再現性を明らかにした、異なる速度の遺伝子と多数の期待 O2-遺伝子。これらのメソッドは、時間をかけて様々 な生物の細胞が低酸素に対応方法を研究するために使用し、他の細胞に発現する遺伝子の研究に適応できます。
Introduction
多くの生物は、遺伝子発現1,2,3を変更することにより低酸素症、または低 O2に応答します。この応答細胞の有酸素呼吸のため、いくつかの生合成反応の重要な基板の欠如と、変化する酸化還元状態4を対処するために役立ちます。出芽酵母で実行されるいくつかのマイクロ アレイ研究を示す低酸素5,6,7,8,9への応答で何百もの遺伝子の mRNA のレベルが変更されます。,10,11,12です。 最近、RNA シーケンスは低酸素症13時に時間をかけて遺伝子発現変動を特徴付けるために使用されました。ここでは、実験の詳細が表示されますと説明しました。
低酸素は O2の別のレベルがそれぞれ、様々 な方法で実現できます。ここでは、低酸素血症が継続的に流れるによって設立された超高純度 N2フラスコに [2] を下げるが再現速度10のすぐに溶解しました。いくつか O2分子存在代謝と遺伝子発現に寄与するが、この環境で嫌気性の近くに非常にあることが可能です。O2がない場合は、酵母細胞は、ピロールポリアミド ヘム、エルゴステ ロール、不飽和脂肪酸4,12,14をことはできません。したがって、酸素5,10,15なし酵母を育てるときは、以前の研究にこれらの代謝物質が含まれています。ただし、これらの代謝物質の枯渇によって仲介される多くの低酸素応答し低酸素遺伝子発現応答12,16を反転従ってそれらを補充します。自然な低酸素状態を模倣するために、これらの代謝物はメディアに追加されませんでした。細胞がこれらの重要な代謝物質が存在しなくても低酸素にさらされた短い時間で細胞死 (データは示されていない) も長期のストレス応答13の顕著な増加がなかった。
応答は、ひずみとその遺伝子型に依存しています。特に重要なは、低酸素応答2の知られている規制当局の対立遺伝子は。S288C 株の背景は、この歪みを使用して実行するその他のゲノム研究と結果を比較することが望ましい。ただし、S288C にはHAP1遺伝子17、低酸素応答の重要な転写因子の部分的な機能喪失の対立遺伝子が含まれています。この対立遺伝子は S288C で修復された、野生型を使用して、Σ1278b からコピーひずみ背景11。
遺伝子の発現は細胞の環境に大きく依存しています。したがって、mRNA 全ゲノム解析を実行すると、時間、刺激、または遺伝子型など別のパラメーターを変えながら一定の環境を維持するために重要です。再現性の高い結果を達成するため、これらの 3 つの事例研究とその生物学的または技術的な複製のすべてを検討してください。まず、同じ experimenter(s) を実行し、研究技術プラクティスは実験者間で異なる場合がありますので。第二に、各バッチがある遺伝子発現に影響を与えることができますわずかに異なる組成としては、成分の同じバッチを成長媒体で使用ください。第三に、細胞周期の影響を最小限に抑えるために各時点で構成されます非同期セルの成長 (1-2 x 107セル/mL) の中間ログの段階で。
低酸素遺伝子発現応答のような複雑な応答を特性評価する際時間コースは様々 なイベントの速度を決定するため有利です。応答の主要な変更をキャプチャする、特定の時間ポイントを選択必要があります。本研究では、過去の実験は、この期間の13の間に遺伝子発現の広範な変化を明らかにしたので、0 と 4 h の時間ポイントが観察された.
世界的な遺伝子発現を測定するには、RNA シーケンス使用18,19であった。このメソッドでは、次世代シーケンサーを使用して、各遺伝子の転写産物の相対量を決定します。RNA seq DNA マイクロ アレイ解析と比較して、(より少なく豊富な転写産物を検出) に対する感受性も高い、(大きいフォールドの変更を測定) に大きなダイナミック レンジ、優れた再現性に正確に時間をかけて遺伝子発現を展示しています。通常、ほとんどの携帯電話の RNA はリボソーム RNA 特定 RNA 種20を豊かにするとても多くの方法が開発されているです。ここでは、浄化するためにポリ A を含む mrna もさまざまな商業的使用されたポリ T ビーズ – 入手可能な rRNA 枯渇キットは mRNA 濃縮に有効である可能性があります。
ここでは、低酸素に出芽酵母遺伝子の発現は特徴付けられました。細胞が低酸素にさらされ、8 の時点でサンプリングし、(0、5、10、30、60、120、180 と 240 分)。再現性を確認するためおよび統計的に変更された成績証明書を識別するには、3 つの生物学的複製を行った。RNA だった機械的破壊とカラム精製により抽出し、RNA シーケンス解析処理し、.ポスト シーケンス処理パイプラインは記述されプログラミング スクリプトは解析の厳密な複製を実行できます。具体的には、Trimmomatic 21、TopHat2 22、HTseq 23、R 統計環境24、DESeq2 パッケージ25を用いて RNA シーケンス データを処理し、中に大幅変更 607 の遺伝子を識別するには低酸素血症。主成分分析 (PCA) および複製の遺伝子発現手法の再現性を示した。クラスタ リングとヒートマップなどは遺伝子の ontology (GO) の分析を示した酸素遺伝子のセットで好気性の呼吸のような多くの細胞プロセスが濃縮され、広範な発現動態を明らかにしました。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では酵母出芽酵母における低酸素の中にすべての遺伝子の mRNA のレベルを測定しました。目標は、制御 – 無酸素環境で成長のためにどのようにグローバル遺伝子発現変動を分析することでした。いくつかの手順は、ここで説明したメソッドが慎重に制御され、再現可能なことを確認に運ばれました。まず、セルの正確に定義された低酸素環境にさらされた: リッチ メディア (YPD) …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
技術的な助言および RNA ライブラリの準備とシーケンス プリンストン大学統合ゲノミクス シーケンス中核施設、ルイス Sigler 研究所に感謝しますこの作品は、ローワン大学と NIH 日の出 R15GM113187 からの M.J.H. に補助金によって支えられました。
Materials
| Enclosed dry incubator | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | Set at 30°C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures. |
| Micro-analysis Filter Holder | Millipore | XX1002530 | 25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125mL filtering flask |
| Strong vacuum | Edwards | E-LAB 2 | The “house” vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here. |
| 1000-mL flask | To act as vacuum trap. | ||
| ~2-foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in | Tygon | 38TT | Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system. |
| High-pressure N2 gas tank | 99.999% purity, >1000psi, with a regulator and gas flow controller | ||
| Autoclaved 500mL flask | Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain. | ||
| Autoclaved 250mL flasks | Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps. | ||
| Flask stoppers (size 6, two holes with 5mm diameter) | Sterilized with 70% ethanol. One for each flask. | ||
| Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm | Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes. | ||
| ~25-cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm | Tygon | E-3603 | One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol. |
| Sterile filter discs | Millipore | HAWP02500 | 25mm diameter, 0.45 µm pore size, one for each time point |
| Sterile dH2O (~100mL) | |||
| 1-mL cuvettes | For measuring OD600 (i.e., cell concentration) | ||
| 50-mL sterile centrifuge tubes | One for each time point | ||
| Clean and sterile tweezers | |||
| liquid nitrogen | For freezing cells | ||
| acid-washed beads | Sigma | G8772 | Keep at 4°C for lysing cells |
| Qiagen RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For RNA column purification |
| Qiagen RLT buffer | Prepare by adding 10µL of β-Mercaptoethanol per 1mL of RLT buffer, keep at 4C. | ||
| 2-mL collection tubes | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RPE | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RW1 | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| DNase I stock and working solutions | Qiagen | 79254 | The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550µL of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20°C) in single-use aliquots (80µL each). The stock solution should not be thawed and refrozen. |
| Buffer RDD | Qiagen | included in the Qiagen DNase Kit | |
| Ice cold 2-mL screw-cap tubes | For lysing cells during RNA extraction | ||
| bead mill homogenizer | Biospec Mini-Beadbeater-24 | 112011 | Keep in cold room |
| Bacto Peptone | BD | DF0118 | for liquid YPD media |
| Bacto Yeast Extract | BD | DF0886 | for liquid YPD media |
| glucose | Fisher | D16 | for liquid YPD media |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher | Q32856 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fisher | Q32853 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM RNA Assay Kit | Thermo Fisher | Q32855 | for measuring nucleic acid concentration |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | for measuring nucleic acid concentration |
| Commercial electrophoresis system | Agilent | Bioanalyzer 2100 | for measuring nucleic acid quality |
| Next-generation sequencer | Illumina | HiSeq 2500 | for sequencing libraries |
| automated liquid handling system | Wafergen | Apollo 324 | for creating sequencing libraries |
| PrepX PolyA mRNA Isolation Kit | Wafergen | 400047 | for isolating mRNA from total RNA |
| PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit | Wafergen | 400039 | for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA |
| Barcode Splitter | https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d | ||
| Samtools, which includes the gzip command | http://www.htslib.org/download/ | ||
| Trimmomatic | http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | ||
| Bowtie2 (installed before TopHat) | http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | ||
| TopHat | https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml | ||
| HTSeq | http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html | ||
| R (installed before R Studio) | https://cran.rstudio.com | ||
| R Studio (free version) | https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
Referências
- Semenza, G. L. Oxygen sensing, homeostasis, and disease. New Eng. J Med. 365 (6), 537-547 (2011).
- Butler, G. Hypoxia and gene expression in eukaryotic microbes. Annu. Rev. Micro. 67, 291-312 (2013).
- Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing and hypoxia signalling pathways in animals: the implications of physiology for cancer. J. Physiol. 591 (Pt 8), 2027-2042 (2013).
- Rosenfeld, E., Beauvoit, B. Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen bySaccharomyces cerevisiae. Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).
- Ter Linde, J. J., et al. Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 181 (24), 7409-7413 (1999).
- Ter Linde, J. J., Steensma, H. Y. A microarray-assisted screen for potential Hap1 and Rox1 target genes in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 19 (10), 825-840 (2002).
- Kwast, K. E., et al. Genomic analyses of anaerobically induced genes in Saccharomyces cerevisiae: functional roles of Rox1 and other factors in mediating the anoxic response. J. Bacteriol. 184 (1), 250-265 (2002).
- Becerra, M., et al. The yeast transcriptome in aerobic and hypoxic conditions: effects of hap1, rox1, rox3 and srb10 deletions. Mol. Microbiol. 43 (3), 545-555 (2002).
- Lai, L. -. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Dynamical remodeling of the transcriptome during short-term anaerobiosis in Saccharomyces cerevisiae: differential response and role of Msn2 and/or Msn4 and other factors in galactose and glucose media. Mol. Cell. Biol. 25 (10), 4075-4091 (2005).
- Lai, L. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Metabolic-State-Dependent Remodeling of the Transcriptome in Response to Anoxia and Subsequent Reoxygenation in Saccharomyces cerevisiae. Euk. Cell. 5 (9), 1468-1489 (2006).
- Hickman, M. J., Winston, F. Heme levels switch the function of Hap1 of Saccharomyces cerevisiae between transcriptional activator and transcriptional repressor. Mol. Cell. Biol. 27 (21), 7414-7424 (2007).
- Hickman, M. J., Spatt, D., Winston, F. The Hog1 mitogen-activated protein kinase mediates a hypoxic response in Saccharomyces cerevisiae. Genética. 188 (2), 325-338 (2011).
- Bendjilali, N., et al. Time-Course Analysis of Gene Expression During the Saccharomyces cerevisiae Hypoxic Response. G3. 7 (1), 221-231 (2017).
- Chellappa, R., et al. The membrane proteins, Spt23p and Mga2p, play distinct roles in the activation of Saccharomyces cerevisiae OLE1 gene expression. Fatty acid-mediated regulation of Mga2p activity is independent of its proteolytic processing into a soluble transcription activator. J. Biol. Chem. 276 (47), 43548-43556 (2001).
- Abramova, N. E., et al. Regulatory mechanisms controlling expression of the DAN/TIR mannoprotein genes during anaerobic remodeling of the cell wall in Saccharomyces cerevisiae. Genética. 157 (3), 1169-1177 (2001).
- Hughes, A. L., Todd, B. L., Espenshade, P. J. SREBP Pathway Responds to Sterols and Functions as an Oxygen Sensor in Fission Yeast. Cell. 120 (6), 831-842 (2005).
- Gaisne, M., Bécam, A. M., Verdière, J., Herbert, C. J. A "natural" mutation in Saccharomyces cerevisiae strains derived from S288c affects the complex regulatory gene HAP1 (CYP1). Curr. Gen. 36 (4), 195-200 (1999).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Gen. 10 (1), 57-63 (2009).
- Anders, S., Huber, W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol. 11 (10), R106 (2010).
- Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biol. 17 (1), 13 (2016).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq–A Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinf. 31 (2), 166-169 (2015).
- . R: A Language and Environment for Statistical Computing Available from: https://www.R-project.org (2015)
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- Brown, T., Mackey, K., Du, T. Analysis of RNA by Northern and Slot Blot Hybridization. Curr. Prot. Mol. Biol. 74, 4.9.1-4.9.19 (2004).
- Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nuc. Acids Res. 30 (1), 207-210 (2002).
- Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nuc. Acids Res. 40, D700-D705 (2012).
- Hothorn, T., Everitt, B. S. . A Handbook of Statistical Analyses using R. , (2014).
- Saldanha, A. J. Java Treeview–extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
- Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Nat. Acad. Sci. 95 (25), 14863-14868 (1998).
- Davies, B. S. J., Rine, J. A Role for Sterol Levels in Oxygen Sensing in Saccharomyces cerevisiae. Genética. 174 (1), 191-201 (2006).
- Meena, R. C., Kumar, N., Nath, S., Chakrabarti, A. Homologous Recombination is Activated at Early Time Points Following Exposure to Cobalt Chloride Induced Hypoxic Conditions in Saccharomyces cerevisiae. Ind. J. Microb. 52 (2), 209-214 (2012).
- Snoek, I. S. I., Tai, S. L., Pronk, J. T., Yde Steensma, H., Daran, J. -. M. Involvement of Snf7p and Rim101p in the transcriptional regulation of TIR1 and other anaerobically upregulated genes in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 10 (4), 367-384 (2010).
- Ellahi, A., Thurtle, D. M., Rine, J. The Chromatin and Transcriptional Landscape of Native Saccharomyces cerevisiae Telomeres and Subtelomeric Domains. Genética. 200 (2), 505-521 (2015).
- Collart, M. A., Oliviero, S., et al. Preparation of yeast RNA. Curr. Prot. Mol. Biol. , (2001).
- Blankenberg, D., et al. Manipulation of FASTQ data with Galaxy. Bioinf. 24 (14), 1783-1785 (2010).
- Martini, P., et al. timeClip: pathway analysis for time course data without replicates. BMC Bioinf. 15, (2014).
- Oh, S., Song, S., Grabowski, G., Zhao, H., Noonan, J. P. Time series expression analyses using RNA-seq: a statistical approach. BioMed Res. Int. 2013, 1-16 (2013).
