Avaliação das propriedades das células endoteliais utilizando cultura de células 3D e sangue não anticoagulado anticoagulantes e anti-inflamatório
Summary
Apresentamos um modelo in vitro que permite o estudo e a análise de coagulação em inteiro, sangue não anticoagulado. Anticoagulação no sistema depende do efeito anticoagulante natural das células endoteliais saudáveis e ativação de células endoteliais resultará na coagulação.
Abstract
In vivo, as células endoteliais são cruciais para a anticoagulação natural de sangue em circulação. Consequentemente, ativação de células endoteliais leva a coagulação do sangue. Este fenômeno é observado em muitas situações clínicas, como a transplantação de órgãos, na presença de pré-formado anticorpos antidoadores, incluindo Xenoenxerto, bem como na lesão de isquemia/reperfusão. A fim de reduzir a experimentação animal de acordo com as 3R padrões (redução, substituição e refinamento), em vitro modelos para estudar o efeito da célula endotelial, ativação na coagulação do sangue seria altamente desejável. No entanto, os sistemas comuns do leito de cultura de células endoteliais fornecem uma relação superfície-volume 1-5 cm2 do endotélio por mL de sangue, que não é suficiente para anticoagulação natural, endotelial mediada. Cultivo de células endoteliais em grânulos de microcarrier pode aumentar a proporção de superfície e o volume de 40-160 cm2/mL. Esta proporção de aumentada é suficiente para garantir a anticoagulação “natural” de sangue, para que o uso de anticoagulantes pode ser evitado. Aqui um em vitro microcarrier sistema é descrito para estudar os efeitos da modificação genética das células endoteliais dos suínos na coagulação do sangue humano de todo, não-anticoagulado. No ensaio descrito, principais células endoteliais aórtica porcinos, ou tipo selvagem (WT) ou transgénicos para humanos CD46 e trombomodulina, foram cultivadas em grânulos microcarrier e então exposto ao sangue humano recentemente colhida não-anticoagulado. Este modelo permite a medição e quantificação da liberação de citocinas, bem como ativação marcadores de complemento e da coagulação no plasma sanguíneo. Além disso, proteínas de complemento e da coagulação em grânulos endotelializados imagem de células endoteliais ativadas e deposição de imunoglobulinas, foram realizadas por microscopia confocal. Este ensaio também pode ser usado para testar medicamentos que servem para prevenir a coagulação e, assim, a ativação de células endoteliais. Em cima de seu potencial para reduzir o número de animais utilizados para tais investigações, o ensaio descrito é consistentemente reprodutível e fácil de executar.
Introduction
O endotélio vascular é composto por uma monocamada de células endoteliais (CE), que linha o lúmen dos vasos sanguíneos. Em um estado fisiológico, quiescente CE são responsáveis para a manutenção de um ambiente anti-inflamatória e anticoagulante. 1 isso é mediado pela expressão de anticoagulante e anti-inflamatório proteínas na superfície do CE. Por exemplo, ativação de CE causada por isquemia/reperfusão lesão ou rejeição vascular (xeno-) transplantado resultados de órgãos em uma mudança da superfície endotelial de um anticoagulante e anti-inflamatório estado a um pro-coagulantes e pro-inflamatórios Estado. 1
Para estudar a interação entre os endotélio e coagulação fatores, em vitro modelos que imitam como fascinante e complexa quanto possível a situação no vivo são altamente desejáveis. Uma limitação comum que caracteriza convencional em vitro ensaios de coagulação é o uso do sangue total anticoagulado que faz a análise dos efeitos mediados por coagulação árdua e recalcificação mesmo de sangue citratado não pode se reproduzir. resultados obtidos com sangue fresco não-anticoagulado. 2 além disso, em sistemas de cultura de células de leito tradicional é impossível para explorar as propriedades anticoagulantes do endotélio como uma superfície de células endoteliais suficiente por volume de sangue não pode ser alcançada. O modelo apresentado aqui supera estas limitações por cultivo CE na superfície dos grânulos esféricos microcarrier, para que uma relação de superfície-para-sangue de CE de > 16cm2/mL pode ser alcançado, que é semelhante à situação em pequenas arteríolas ou veias, e que foi descrito para ser suficientes para permitir anticoagulação “natural” do sangue pela superfície de CE. 3 , 4 o sangue total pode ser usado sem anticoagulantes adicionados neste cenário. Amostras de sangue podem ser coletadas durante o experimento e citocinas, fatores de coagulação e marcadores de ativação do complemento solúvel podem ser detectados e quantificados. Além disso, microcarrier CE-revestido grânulos podem ser analisados para deposição de complemento e imunoglobulina, bem como a expressão de marcadores de ativação de CE por microscopia confocal. Outra interessante aplicação inclui os testes de drogas que deveriam para prevenir a coagulação e, assim, a ativação de células endoteliais. 5 apesar deste modelo não pode substituir completamente a experimentação animal, oferece um método para testar hipóteses funcionais específicas ex vivo usando células e, assim, reduzir o número de animais utilizados em pesquisa básica na isquemia/reperfusão transplante de lesão ou (xeno).
O modelo descrito foi usado para imitar um Xenoenxerto definindo em quais células endoteliais aórtica porcinos (PAEC) são cultivadas em grânulos microcarrier e incubadas com inteiros, não-anticoagulado sangue humano. Diferente transgênico PAEC, carregando vários genes humanos tais como CD46 para a regulação do sistema complemento e/ou trombomodulina (hTBM) para a regulação do sistema de coagulação, analisaram-se por suas propriedades anticoagulantes. Sistemas de coagulação, complemento e ativação de células endoteliais são rigidamente controlados e interligados. 6 portanto, é importante compreender como as diferentes células transgênicas se comportar após a exposição ao sangue humano, no que respeita à expressão da molécula de adesão e liberação de citocinas, derramamento do glicocálix e perda de proteínas anticoagulantes. 7
Protocol
Representative Results
Discussion
O modelo apresentado aqui é apropriado para coagulação relacionados com estudos, permitindo a análise de diferentes aspectos da coagulação e sua interação com a CE. 8 em pesquisa de Xenoenxerto, é um sistema útil para testar as propriedades anticoagulantes de diferentes ECs suínos geneticamente modificados após incubação com sangue humano 9.
Os passos mais importantes do protocolo são aqueles garantindo cobertura de celular complet…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi suportado pela Fundação Suíça de ciência nacional (SNSF, Grant No. 320030_156193). Os autores agradecer Dr. Benoît Werlen para fornecer os grânulos de microcarrier de Biosilon. Agradecemos também Prof Hans Peter Kohler e Prof André Haeberli pela ajuda com a criação do modelo de grânulo de microcarrier.
Materials
| PAEC | Isolated from pig aorta in our Lab | ||
| Microcarrier beads (Biosilon) | Thermo Fisher Scientific | 160-250 | |
| Collagen I, Bovine | Gibco | A10644-01 | |
| DMEM | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Sigma | M7528 | |
| RPMI | Gibco | 32404-014 | |
| Neutral tubes | Sarstedt | 02.1726.001 | |
| Polypropylene tubes | Simport | T406-2A | |
| Stirrer flasks | Tecnomara | ||
| Biological stirrer | Brouwer | MCS-104S | |
| Rat anti CD31 | R&D Systems | MAB33871 | Dilution 1:100 |
| Goat anti-rat IgG-Cy3 | Jackson Immuno Research | 112-166-003 | Dilution 1:500 |
| Goat anti VE-cadherin | Santa Cruz | sc-6458 | Dilution 1:100 |
| Rabbit anti vWF | DAKO | A0082 | Dilution 1:100 |
| Dk anti Gt IgG – Alexa 488 | Molecular Probes | A11055 | Dilution 1:500 |
| Goat anti Rabbit – FITC | Southern Biotech | 4050-02 | Dilution 1:500 |
| DAPI | Sigma | 32670-25MG-F | Dilution 1 µg/mL |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Concentration: 10% in cell culture medium |
| Needle | Becton Dickinson | 367286 | Size: 0.8×19 mm (21ɢ 3/4") |
| Adapter | Sarstedt | 14.1205 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 710 | |
| Image analysis software | Image J | Available for free at: https://imagej.net | |
| Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix | PromoCell | C-39216 | 2mL in 500mL of DMEM |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Concentration: 1% in cell culture medium |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-024 | Concentration: 1% in cell culture medium |
| Heparinun natricum | Drossa Pharm AG | Stock concentration: 5000 U.I./ mL | |
| Chamberslides | Bioswisstec AG | 30108 | |
| CaCl2 x 2H2O | Merck | 2382.0500 | |
| MgCl2 x6 H2O | Merck | 1.5833.1000 | |
| Tween 20 | Axon Lab AG | 9005-64-5 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Glycergel mounting medium | Dako | C0563 |
Referências
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