DNA-Polymerase activiteit Assay gebruikend nabij-infrarood fluorescerende gelabelde DNA gevisualiseerd door Acrylamide Gel elektroforese
Summary
Dit protocol beschrijft de karakterisatie van de polymerase van DNA synthese van gemodificeerd DNA door middel van observatie van wijzigingen in het nabij-infraroodspectrum fluorescently geëtiketteerde DNA met behulp van de Elektroforese van het gel en gel beeldvorming. Acrylamide gels worden gebruikt voor hoge resolutie beeldvorming van de scheiding van korte nucleic zuren, die op verschillende tarieven afhankelijk van grootte migreren.
Abstract
Voor elk enzym zijn robuuste, kwantitatieve methoden vereist voor de karakterisering van zowel inheemse als gemanipuleerde enzymen. Voor de polymerase van DNA, kan DNA-synthese worden gekarakteriseerd met behulp van een in vitro DNA synthese assay gevolgd door polyacrylamide gelelektroforese. Het doel van deze test is te kwantificeren synthese van zowel natuurlijke DNA en gemodificeerd DNA (M-DNA). Deze methoden zijn vooral handig voor het oplossen van oligonucleotides met één nucleotide resolutie, zodat de waarneming van afzonderlijke stappen tijdens enzymatische oligonucleotide synthese. Deze methoden zijn toegepast op de evaluatie van een serie van biochemische en biofysische eigenschappen zoals het meten van de stationaire toestand snelheidsconstanten van afzonderlijke stappen van de DNA-herstelsynthese, de foutmarge van de synthese van DNA en DNA bindende affiniteit. Bewerkt met behulp van componenten met inbegrip van, maar niet beperkt tot, gemodificeerde nucleoside trifosfaat (NTP), M-DNA en/of mutant polymerase van DNA, de relatieve nut van substraat-DNA-polymerase paren effectief kunnen worden geëvalueerd. Hier, detail we de bepaling zelf, met inbegrip van de wijzigingen die moeten worden verricht voor niet-traditionele primer DNA labeling strategieën zoals nabij-infrarood fluorescently label DNA. Bovendien, we beschikken over gedetailleerde essentiële technische stappen voor acrylamide gel gieten en uitgevoerd, die vaak kan technisch uitdagende.
Introduction
De polymerase van DNA uitvoeren van nauwkeurige en efficiënte DNA-synthese en zijn essentieel voor het behoud van de integriteit van het genoom. De mogelijkheid voor het synthetiseren van honderden nucleotiden per seconde zonder fouten maakt ook DNA polymerase essentiële gereedschappen in de moleculaire biologie en biotechnologie. Echter, deze eigenschappen beperken ook de toepassingen voor M-DNA substraten; in het algemeen, kunnen niet natuurlijke polymerase van DNA synthetiseren veel potentieel waardevolle M-DNA substraten, waarschijnlijk wegens naar de hoge selectieve druk tegen het gebruik van niet-standaard substraten in vivo. Vele groepen hebben ontwikkeld gerichte evolutie benaderingen voor het genereren van mutant DNA-polymerase staat M-DNA synthese1a,2,3,4,5; deze inspanningen hebben uitgebreid de biotechnologische nut van DNA6,7,8.
Voor de evaluatie van het vermogen van mutant DNA-polymerase te synthetiseren M-DNA, wij9,10, e.a.11,12,13 gebruiken meestal metingen in vitro van DNA polymeraseactiviteit, die worden beschreven in dit manuscript. In deze experimenten zijn de polymerase van DNA mede bebroede met een gelabelde primer/sjabloon dubbelzijdig en nucleoside trifosfaat substraten; de producten worden geëvalueerd door gelelektroforese. Afhankelijk van de specifieke vraag van de experimentele, mutant DNA-polymerase, gemodificeerde inleidingen, kunnen gewijzigde sjablonen of gemodificeerde nucleoside trifosfaat worden gebruikt, zodat de systematische biochemische evaluatie van de mutant enzymactiviteit.
Historisch, hebben deze tests vertrouwd op een 5′ radioactieve-etiket voor het bijhouden van DNA-synthese; meestal, 32P en 33P gebruikt zijn; typisch, de etikettering wordt gerealiseerd via T4 polynucleotide kinase11. Echter, als gevolg van de beperkte levensduur en de relatief hoge kosten van radioactieve labels en hun veilige verwijdering, onze groep in plaats daarvan gebruikt een nabij-infrarood fluorophore synthetische 5′ label van DNA. Met behulp van een relatief lage kosten nabij-infrarood gel imager, hebben we waargenomen soortgelijke detectiegrenzen om voorafgaande studies met radioactieve labels (niet-gepubliceerde resultaten). Wij hebben met succes gereproduceerd verleden opmerkingen9, en we hebben niet gezien eventuele grote kwantitatieve verschillen met de eerder gemeten snelheidsconstanten (niet-gepubliceerde resultaten).
Voor het analyseren van de grootte van DNA, en dus de omvang van de DNA-herstelsynthese, vertrouwen wij op polyacrylamide-gel elektroforese methoden oorspronkelijk ontwikkeld voor Sanger sequencing14 vóór de komst van capillaire elektroforese15. De afstand van de scheiding of mobiliteit kan worden gebruikt als een meting met molecuulgewicht; groot formaat, verticale polyacrylamide gels kunnen één nucleotide resolutie, inschakelen van kwantitatieve observatie van DNA oligonucleotides van verschillende lengtes bereiken.
Deze experimenten zijn collectief, een robuuste methode voor de karakterisering van de polymerase. Vanwege de tijd is gevoelige aard van de reacties, de voorbereiding en de zorg nodig om reproduceerbare resultaten. Verder, terwijl de acrylamide gel is een zeer effectieve manier om te meten van de DNA synthese, evenals vele andere DNA wijzigen reacties, met de resolutie van één nucleotide, kan het technisch uitdagende. Het protocol hier zal hopelijk kunnen gebruikers deze experimenten uitvoeren terwijl het vermijden van de meest voorkomende fouten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier, hebben wij beschreven een bepaling om het karakteriseren van de polymerase van DNA-gemedieerde synthese van M-DNA. Met behulp nabij-infrarood gelabelde inleidingen van DNA, en denatureren polyacrylamide gelelektroforese op te lossen van verschillend formaat oligonucleotides, kunnen we één nucleotide resolutie over oligonucleotides, waardoor nauwkeurige meting van synthese. Deze benaderingen kunnen worden gebruikt om te meten of de totale activiteit van het enzym (sectie 2.1) of voor het meten van de parameters va…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Research Corporation voor wetenschappelijke vooruitgang (Cottrell College Scholar Award #22548) en TriLink biotechnologie (ResearchReward Grant #G139).
Materials
| Tris HCl | Promega | H5123 | |
| Tris Base | Promega | H5131 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Acetylated BSA | Promega | PR-R3961 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| Dithiothreitol (i.e. DTT) | Research Products International | D11000 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution) | Sigma | 03690-100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Formamide | Acros | AC42374-5000 | |
| Orange G | Sigma Aldrich | O3756 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | 50-701-6973 | |
| dNTPs | Fisher Scientific | FERR0191 | |
| M-dNTPs (riboNTPs) | Fisher Scientific | 45-001-341 (343, 345, 347) | |
| M-dNTPs (all other modified NTPs) | TriLink Biotechnologies | assorted | |
| primer 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA |
| template 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA |
| Acrylamide | Research Products International | A11405 | 38.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) solid | Research Products International | T22020 | |
| Urea ultrapure | Research Products International | U20200 | |
| Gel tape | CBS Scientific | GT-72-10 | |
| Large white spring clamp polypropylene | CBS Scientific | GPC-0001 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | BP179 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Fisher Scientific | BP15020 | |
| 0.75 mm spacers | CBS Scientific | SGS-20-0740A | |
| 33×42 Notched Glass Plate Set | CBS Scientific | SGP33-040A | |
| Wedge plate separator | CBS Scientific | WPS-100 | |
| Comb for gel electrophoresis | CBS Scientific | SG33-0734 | |
| Gel electrophoresis rig | CBS Scientific | SG-400-33 | |
| ultrapure water | we use a Milli-Q system from Millipore | ||
| DNA polymerases | we prepare these in our laboratory using published protocols. |
Referências
- Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide. J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).
- Chen, T., Romesberg, F. E. Directed polymerase evolution. FEBS letters. 588 (2), 219-229 (2014).
- Leconte, A. M., et al. Directed evolution of DNA polymerases for next-generation sequencing. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (34), 5921-5924 (2010).
- Xia, G., et al. Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6597-6602 (2002).
- Chen, T., et al. Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition and amplification of C2′-modified DNA. Nat Chem. 8 (6), 556-562 (2016).
- Thirunavukarasu, D., Chen, T., Liu, Z., Hongdilokkul, N., Romesberg, F. E. Selection of 2′-Fluoro-Modified Aptamers with Optimized Properties. J Am Chem Soc. 139 (8), 2892-2895 (2017).
- Taylor, A. I., et al. Catalysts from synthetic genetic polymers. Nature. 518 (7539), 427-430 (2015).
- Alves Ferreira-Bravo, I., Cozens, C., Holliger, P., DeStefano, J. J. Selection of 2′-deoxy-2′-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity. Nucleic Acids Res. 43 (20), 9587-9599 (2015).
- Schultz, H. J., et al. Taq DNA Polymerase Mutants and 2′-Modified Sugar Recognition. Bioquímica. 54 (38), 5999-6008 (2015).
- Rosenblum, S. L., et al. Design and discovery of new combinations of mutant DNA polymerases and modified DNA substrates. Chembiochem. 18 (8), 816-823 (2017).
- Creighton, S., Goodman, M. F. Gel kinetic analysis of DNA polymerase fidelity in the presence of proofreading using bacteriophage T4 DNA polymerase. J Biol Chem. 270 (9), 4759-4774 (1995).
- Joyce, C. M., Benkovic, S. J. DNA polymerase fidelity: kinetics, structure, and checkpoints. Bioquímica. 43 (45), 14317-14324 (2004).
- Leconte, A. M., et al. Discovery, characterization, and optimization of an unnatural base pair for expansion of the genetic alphabet. J Am Chem Soc. 130 (7), 2336-2343 (2008).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Karger, B. L., Guttman, A. DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis. Electrophoresis. 30 (Suppl 1), S196-S202 (2009).
- Lawyer, F. C., et al. High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5′ to 3′ exonuclease activity. PCR Methods Appl. 2 (4), 275-287 (1993).
- Lawyer, F. C., et al. Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus. J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).
- Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity. Bioquímica. 30 (3), 804-813 (1991).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).
- Larsen, A. C., et al. A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics. Nat Commun. 7, 11235 (2016).
- Cozens, C., et al. Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2′-5′ Linkages. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).
