DNA Polymerase aktivitet analysen med nær-infrarøde fluorescerende merket DNA visualisert ved akrylamid Gel geleelektroforese
Summary
Denne protokollen beskriver karakterisering av DNA polymerase syntese av endrede DNA gjennom observasjon av endringer i nær-infrarøde fluorescently merket DNA bruker gel gelelektroforese og gel bildebehandling. Akrylamid gels brukes for høy oppløsning bildebehandling for separasjon av kort nucleic syrer, som migrerer til forskjellige priser avhengig av størrelse.
Abstract
For noen enzym kreves robust, kvantitative metoder for karakterisering av både native og utviklet enzymer. For DNA polymerases, kan DNA-syntese karakteriseres ved hjelp i vitro DNA syntese analysen etterfulgt av polyakrylamid gel geleelektroforese. Målet med denne analysen er å tallfeste syntese av både naturlige DNA og endret DNA (M-DNA). Disse metodene er særlig nyttig for å løse oligonucleotides med single nukleotid oppløsning, aktivere observasjon av individuelle trinnene under enzymatisk oligonucleotide syntese. Disse metodene er brukt til evalueringen av en rekke biokjemiske og Biofysiske egenskaper som måling av stabil rente konstantene i enkelttrinn i DNA-syntese, feilrate DNA-syntese og DNA forpliktende tilhørighet. Ved hjelp av endret komponenter, inkludert, men ikke begrenset til, endret nukleosid triphosphates (NTP), M-DNA og/eller mutant DNA polymerases, relativ nytten av underlaget-DNA polymerase par effektivt kan evalueres. Her detalj vi analysen, inkludert endringene som må gjøres for å imøtekomme utradisjonell primer DNA merking strategier som nær-infrarøde fluorescently merket DNA. I tillegg har vi detaljerte avgjørende tekniske tiltak for akrylamid gel helle og kjører, som ofte kan være teknisk utfordrende.
Introduction
DNA polymerases utføre nøyaktige og effektive DNA-syntese og er avgjørende for å opprettholde genomet integritet. Muligheten til å syntetisere hundrevis av nukleotider per sekund uten feil gjør også DNA polymerases viktige verktøy i molekylærbiologi og bioteknologi. Men begrense disse egenskapene også programmene for M-DNA underlag; Generelt naturlig DNA polymerases kan ikke syntetisere mange potensielt verdifulle M-DNA underlag, sannsynligvis skyldes høy selektivt press mot å bruke ikke-standard underlag i vivo. Mange grupper har utviklet regissert utvikling tilnærminger for å generere mutant DNA polymerases kan M-DNA syntese1,2,3,4,5; Dette arbeidet har utvidet bioteknologisk nytten av DNA6,7,8.
Å vurdere muligheten av mutant DNA polymerases å syntetisere M-DNA, vi9,10, og andre11,12,13 bruker vanligvis i vitro målinger av DNA polymerase aktivitet, som er beskrevet i dette manuskriptet. Disse eksperimentene er DNA polymerases co inkubert med merket primer/malen dobbeltsidig og nukleosid trifosfat underlag; produktene er evaluert av gel geleelektroforese. Avhengig av den spesifikke eksperimentelle spørsmål, mutant DNA polymerases, endret primere, kan endret maler eller modifisert nukleosid triphosphates brukes, aktivere systematisk biokjemiske evalueringen av mutant enzymaktiviteten.
Historisk har disse analyser stolt på en 5′ radioaktivt etikett spore DNA-syntese; oftest har 32P og 33P blitt brukt; vanligvis er merking oppnådd ved hjelp av T4 polynucleotide kinase11. Men på grunn av begrenset levetid og relativt høye kostnader av radioaktivt etiketter og deres fjerning bruker vår gruppe i stedet en syntetisk 5′ nær infrarød fluorophore merket DNA. Bruker en relativt lav kostnad nær infrarød gel imager, har vi observert lignende oppdagelsen grenser for tidligere studier med radioaktive etiketter (upubliserte resultater). Vi har vellykket reprodusert forbi observasjoner9, og vi har ikke observert noen store kvantitative forskjell med tidligere målt rate konstanter (upubliserte resultater).
Analysere størrelsen på DNA, og dermed omfanget av DNA-syntese, stole vi på polyakrylamid gel geleelektroforese metodene opprinnelig utviklet for Sanger sekvensering14 før kapillært geleelektroforese15. Avstand av separasjon eller mobilitet kan brukes som et mål på molekylvekt; stort format, loddrett polyakrylamid gels kan oppnå single nukleotid oppløsning, aktivere kvantitative observasjon av DNA oligonucleotides av varierende lengde.
Samlet er disse eksperimentene en robust metode for polymerase karakterisering. På grunn av tiden er følsomme natur reaksjoner, forberedelse og omsorg nødvendig for å oppnå reproduserbar resultater. Videre, mens akrylamid gel er en effektiv måte å måle DNA-syntese, samt mange andre DNA endring reaksjoner, med single nukleotid oppløsning, kan det være teknisk utfordrende. Protokollen her vil forhåpentligvis gi brukere utføre disse eksperimentene og unngå de vanligste feilene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her har vi beskrevet analysen betegner DNA polymerase-mediert syntesen M-DNA. Ved hjelp av nær-infrarøde merket DNA primere, og bruker denaturing polyakrylamid gel geleelektroforese for å løse annerledes størrelse oligonucleotides, kan vi få single nukleotid oppløsning på oligonucleotides, muliggjør nøyaktig måling av syntese. Disse metodene kan brukes enten måle den totale aktiviteten av enzymet (inndelingen 2.1) eller måle Michaelis-Menten parameterne i enkelttrinn (Merk etter trinn 2.1). Våre lab har nyl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Research Corporation for vitenskapelige framgang (Cottrell College Scholar Award #22548) og TriLink bioteknologi (ResearchReward Grant #G139).
Materials
| Tris HCl | Promega | H5123 | |
| Tris Base | Promega | H5131 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Acetylated BSA | Promega | PR-R3961 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| Dithiothreitol (i.e. DTT) | Research Products International | D11000 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution) | Sigma | 03690-100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Formamide | Acros | AC42374-5000 | |
| Orange G | Sigma Aldrich | O3756 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | 50-701-6973 | |
| dNTPs | Fisher Scientific | FERR0191 | |
| M-dNTPs (riboNTPs) | Fisher Scientific | 45-001-341 (343, 345, 347) | |
| M-dNTPs (all other modified NTPs) | TriLink Biotechnologies | assorted | |
| primer 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA |
| template 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA |
| Acrylamide | Research Products International | A11405 | 38.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) solid | Research Products International | T22020 | |
| Urea ultrapure | Research Products International | U20200 | |
| Gel tape | CBS Scientific | GT-72-10 | |
| Large white spring clamp polypropylene | CBS Scientific | GPC-0001 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | BP179 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Fisher Scientific | BP15020 | |
| 0.75 mm spacers | CBS Scientific | SGS-20-0740A | |
| 33×42 Notched Glass Plate Set | CBS Scientific | SGP33-040A | |
| Wedge plate separator | CBS Scientific | WPS-100 | |
| Comb for gel electrophoresis | CBS Scientific | SG33-0734 | |
| Gel electrophoresis rig | CBS Scientific | SG-400-33 | |
| ultrapure water | we use a Milli-Q system from Millipore | ||
| DNA polymerases | we prepare these in our laboratory using published protocols. |
Referências
- Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide. J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).
- Chen, T., Romesberg, F. E. Directed polymerase evolution. FEBS letters. 588 (2), 219-229 (2014).
- Leconte, A. M., et al. Directed evolution of DNA polymerases for next-generation sequencing. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (34), 5921-5924 (2010).
- Xia, G., et al. Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6597-6602 (2002).
- Chen, T., et al. Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition and amplification of C2′-modified DNA. Nat Chem. 8 (6), 556-562 (2016).
- Thirunavukarasu, D., Chen, T., Liu, Z., Hongdilokkul, N., Romesberg, F. E. Selection of 2′-Fluoro-Modified Aptamers with Optimized Properties. J Am Chem Soc. 139 (8), 2892-2895 (2017).
- Taylor, A. I., et al. Catalysts from synthetic genetic polymers. Nature. 518 (7539), 427-430 (2015).
- Alves Ferreira-Bravo, I., Cozens, C., Holliger, P., DeStefano, J. J. Selection of 2′-deoxy-2′-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity. Nucleic Acids Res. 43 (20), 9587-9599 (2015).
- Schultz, H. J., et al. Taq DNA Polymerase Mutants and 2′-Modified Sugar Recognition. Bioquímica. 54 (38), 5999-6008 (2015).
- Rosenblum, S. L., et al. Design and discovery of new combinations of mutant DNA polymerases and modified DNA substrates. Chembiochem. 18 (8), 816-823 (2017).
- Creighton, S., Goodman, M. F. Gel kinetic analysis of DNA polymerase fidelity in the presence of proofreading using bacteriophage T4 DNA polymerase. J Biol Chem. 270 (9), 4759-4774 (1995).
- Joyce, C. M., Benkovic, S. J. DNA polymerase fidelity: kinetics, structure, and checkpoints. Bioquímica. 43 (45), 14317-14324 (2004).
- Leconte, A. M., et al. Discovery, characterization, and optimization of an unnatural base pair for expansion of the genetic alphabet. J Am Chem Soc. 130 (7), 2336-2343 (2008).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Karger, B. L., Guttman, A. DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis. Electrophoresis. 30 (Suppl 1), S196-S202 (2009).
- Lawyer, F. C., et al. High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5′ to 3′ exonuclease activity. PCR Methods Appl. 2 (4), 275-287 (1993).
- Lawyer, F. C., et al. Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus. J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).
- Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity. Bioquímica. 30 (3), 804-813 (1991).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).
- Larsen, A. C., et al. A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics. Nat Commun. 7, 11235 (2016).
- Cozens, C., et al. Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2′-5′ Linkages. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).
