DNA-polymeras aktivitet Assay använder infrarött fluorescerande märkt DNA visualiseras med akrylamid gelelektrofores
Summary
Det här protokollet beskriver karakterisering av DNA-polymeras syntes av modifierad DNA genom observation av infrarött fluorescently märkt DNA med hjälp av gelelektrofores och gel imaging-förändringar. Akrylamid geler används för högupplöst avbildning av avskiljandet av kort nucleic syror, som vandrar i olika takt beroende på storlek.
Abstract
För varje enzym krävs robusta, kvantitativa metoder för karakterisering av både infödda och konstruerade enzymer. För DNA-polymerases, kan DNA-syntesen karakteriseras med hjälp av ett in vitro- DNA syntesen test följt av polyakrylamid gelelektrofores. Målet med denna analys är att kvantifiera syntes av både naturliga DNA och modifierad DNA (M-DNA). Dessa metoder är särskilt användbara för att lösa oligonukleotider med enda nukleotid upplösning, möjliggör observation av enskilda stegen under enzymatisk oligonukleotiden syntes. Dessa metoder har tillämpats till utvärderingen av en rad biokemiska och biofysiska egenskaper såsom mätning av steady state konstanter av enskilda stegen av DNA-syntes, felprocenten av DNA-syntes och DNA affinitet. Genom att använda modifieras komponenter inklusive, men inte begränsat till, modifierade nukleosid trifosfater (NTP), M-DNA och/eller muterade DNA polymeraser, relativa nyttan av substrat-DNA-polymeras som par kan utvärderas effektivt. Här, detalj vi analysen själv, inklusive de ändringar som måste göras för att tillgodose icke traditionella primer DNA märkning strategier såsom infrarött fluorescently märkt DNA. Dessutom vi har detaljerade avgörande tekniska steg för akrylamid gel hälla och kör, som ofta kan vara tekniskt utmanande.
Introduction
DNA-polymerases utför noggranna och effektiva DNA-syntes och är avgörande för att bibehålla genomet integritet. Förmågan att syntetisera hundratals nukleotider per sekund utan att göra fel gör också DNA-polymerases viktiga verktyg inom molekylärbiologi och bioteknik. Dock begränsa dessa egenskaper också vilka program för M-DNA substrat; generellt sett inte kan naturliga DNA-polymerases syntetisera många potentiellt värdefulla M-DNA substrat, sannolikt på grund att den höga selektionstryck mot att använda icke-standardiserade substrat i vivo. Många grupper har utvecklat riktad evolution metoder för att generera muterat DNA-polymerases kan M-DNA syntesen1a,2,3,4,5. dessa ansträngningar har utökat det biotekniska verktyget av DNA6,7,8.
Att utvärdera muterat DNA-polymerases förmåga att syntetisera M-DNA, vi9,10, och andra11,12,13 använder vanligtvis in vitro- mätningar av DNA polymeras aktivitet, som beskrivs i detta manuskript. I dessa experiment är DNA-polymerases samtidig ruvade med en märkt primer/mall duplex och nukleosid trifosfat substrat; produkterna utvärderas med gelelektrofores. Beroende på den specifika experimentella fråga, muterat DNA-polymerases, modifierade primers, kan modifierade mallar eller modifierade nukleosid trifosfater användas, möjliggör systematiska biokemiska utvärderingen av muterade enzymaktiviteten.
Historiskt har dessa analyser har förlitat sig på en 5′ radioaktiva etikett att spåra DNA-syntes; vanligast, har 32P och 33P använts. typiskt, märkning uppnås med T4 polynucleotide kinase11. Dock på grund av den begränsad livslängd och relativt höga kostnaderna för radioaktiva etiketter och deras säkert bortskaffande använder vår grupp i stället en syntetisk 5′ nära-infraröd fluorophore märkt DNA. Med en relativt låg kostnad nära infrarött gel imager, har vi observerat liknande detektionsgränser till tidigare studier med radioaktivt etiketter (opublicerade resultat). Vi har framgångsrikt återgav tidigare observationer9, och vi har inte observerat någon stor kvantitativ skillnad med tidigare uppmätta konstanter (opublicerade resultat).
För att analysera DNA storlek, och därmed omfattningen av DNA-syntes, litar vi på polyakrylamid gelelektrofores metoder utvecklades ursprungligen för Sanger sekvensering14 före tillkomsten av kapillärelektrofores15. Distansera av separation eller rörlighet kan användas som ett mått på molekylvikt; stort format, vertikala polyakrylamidgeler kan nå enda nukleotid upplösning, möjliggör kvantitativa observation av DNA oligonukleotider av varierande längd.
Sammantaget är dessa experiment en robust metod för polymeras karakterisering. På grund av tiden är känsliga reaktioner, förberedelse och vård nödvändigt för att uppnå reproducerbara resultat. Ytterligare, medan den akrylamid gel är ett mycket effektivt sätt att mäta DNA-syntes, liksom många andra DNA modifiera reaktioner, med enda nukleotid upplösning, kan det vara tekniskt utmanande. Protokollet här kommer förhoppningsvis att användare ska kunna utföra dessa experiment samtidigt undvika de vanligaste misstagen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här har vi beskrivit ett test för att karakterisera DNA-polymeras-medierad syntesen av M-DNA. Genom att använda infrarött märkt DNA primers och använder denatureringen polyakrylamid gelelektrofores för att lösa olika stora oligonukleotider, kan vi få enda nukleotid resolution om oligonukleotider, möjliggör exakt mätning av syntes. Dessa metoder kan användas till antingen mäta den totala aktiviteten av enzymet (avsnitt 2.1) eller att mäta Michaelis-Menten parametrarna för enskilda stegen (Observera följan…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete fick stöd av forskning Corporation för vetenskapens framsteg (Cottrell College Scholar Award #22548) och av TriLink Biotechnologies (ResearchReward Grant #G139).
Materials
| Tris HCl | Promega | H5123 | |
| Tris Base | Promega | H5131 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Acetylated BSA | Promega | PR-R3961 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| Dithiothreitol (i.e. DTT) | Research Products International | D11000 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution) | Sigma | 03690-100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Formamide | Acros | AC42374-5000 | |
| Orange G | Sigma Aldrich | O3756 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | 50-701-6973 | |
| dNTPs | Fisher Scientific | FERR0191 | |
| M-dNTPs (riboNTPs) | Fisher Scientific | 45-001-341 (343, 345, 347) | |
| M-dNTPs (all other modified NTPs) | TriLink Biotechnologies | assorted | |
| primer 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA |
| template 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA |
| Acrylamide | Research Products International | A11405 | 38.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) solid | Research Products International | T22020 | |
| Urea ultrapure | Research Products International | U20200 | |
| Gel tape | CBS Scientific | GT-72-10 | |
| Large white spring clamp polypropylene | CBS Scientific | GPC-0001 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | BP179 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Fisher Scientific | BP15020 | |
| 0.75 mm spacers | CBS Scientific | SGS-20-0740A | |
| 33×42 Notched Glass Plate Set | CBS Scientific | SGP33-040A | |
| Wedge plate separator | CBS Scientific | WPS-100 | |
| Comb for gel electrophoresis | CBS Scientific | SG33-0734 | |
| Gel electrophoresis rig | CBS Scientific | SG-400-33 | |
| ultrapure water | we use a Milli-Q system from Millipore | ||
| DNA polymerases | we prepare these in our laboratory using published protocols. |
Referências
- Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide. J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).
- Chen, T., Romesberg, F. E. Directed polymerase evolution. FEBS letters. 588 (2), 219-229 (2014).
- Leconte, A. M., et al. Directed evolution of DNA polymerases for next-generation sequencing. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (34), 5921-5924 (2010).
- Xia, G., et al. Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6597-6602 (2002).
- Chen, T., et al. Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition and amplification of C2′-modified DNA. Nat Chem. 8 (6), 556-562 (2016).
- Thirunavukarasu, D., Chen, T., Liu, Z., Hongdilokkul, N., Romesberg, F. E. Selection of 2′-Fluoro-Modified Aptamers with Optimized Properties. J Am Chem Soc. 139 (8), 2892-2895 (2017).
- Taylor, A. I., et al. Catalysts from synthetic genetic polymers. Nature. 518 (7539), 427-430 (2015).
- Alves Ferreira-Bravo, I., Cozens, C., Holliger, P., DeStefano, J. J. Selection of 2′-deoxy-2′-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity. Nucleic Acids Res. 43 (20), 9587-9599 (2015).
- Schultz, H. J., et al. Taq DNA Polymerase Mutants and 2′-Modified Sugar Recognition. Bioquímica. 54 (38), 5999-6008 (2015).
- Rosenblum, S. L., et al. Design and discovery of new combinations of mutant DNA polymerases and modified DNA substrates. Chembiochem. 18 (8), 816-823 (2017).
- Creighton, S., Goodman, M. F. Gel kinetic analysis of DNA polymerase fidelity in the presence of proofreading using bacteriophage T4 DNA polymerase. J Biol Chem. 270 (9), 4759-4774 (1995).
- Joyce, C. M., Benkovic, S. J. DNA polymerase fidelity: kinetics, structure, and checkpoints. Bioquímica. 43 (45), 14317-14324 (2004).
- Leconte, A. M., et al. Discovery, characterization, and optimization of an unnatural base pair for expansion of the genetic alphabet. J Am Chem Soc. 130 (7), 2336-2343 (2008).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Karger, B. L., Guttman, A. DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis. Electrophoresis. 30 (Suppl 1), S196-S202 (2009).
- Lawyer, F. C., et al. High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5′ to 3′ exonuclease activity. PCR Methods Appl. 2 (4), 275-287 (1993).
- Lawyer, F. C., et al. Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus. J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).
- Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity. Bioquímica. 30 (3), 804-813 (1991).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).
- Larsen, A. C., et al. A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics. Nat Commun. 7, 11235 (2016).
- Cozens, C., et al. Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2′-5′ Linkages. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).
